剁辣椒中优良乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性分析

叶 陵，李 勇，王蓉蓉，刘成国，蒋立文，邓放明，周 辉,*

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南省食品科学与生物技术重点实验室，湖南 长沙 410128；2.张家界灵洁绿色食品有限公司，湖南 张家界 427000）

我国是辣椒最大的生产国，辣椒的初加工主要有干制、腌制、油制、泡渍等，其中腌制辣椒包括剁辣椒、泡辣椒、辣椒酱等发酵辣椒产品。发酵是蔬菜的一种最简单和方便的加工保存方法[1]，自然发酵辣椒主要是利用其天然辣椒表面附着的乳酸菌进行的发酵，经过乳酸菌厌氧发酵以后，其味酸辣、可口，并且具有开胃的功能。

剁辣椒属于发酵辣椒，其传统加工方法是利用乳酸菌的自然发酵和食盐保存作用进行加工处理，目前剁辣椒加工企业普遍采用20%以上的高盐腌制辣椒的方法进行加工，这样虽然可保留辣椒的色泽、辣味和脆度，但是产品没有发酵辣椒特有的风味和香气，而且加工食用前要经过脱盐处理，这样增加了生产成本，同时也造成了环境的污染。因此，选用安全、耐盐、耐酸同时具有亚硝酸盐降解能力的优良乳酸菌进行辣椒的接种发酵，成为提高发酵辣椒品质的重要途径。

目前从剁辣椒中分离出的乳酸菌主要是植物乳杆菌、短乳杆菌、戊糖片球菌等，但以乳杆菌为主[2-6]，由于已有研究分离的剁辣椒样本较少，分离出的乳酸菌数量少，分离乳杆菌的发酵产酸、降解亚硝酸盐、耐盐、耐酸及安全性等特性并未得到有效的评价。为充分了解剁辣椒中乳酸菌的上述特性，本研究首先从12 份剁辣椒样品中分离出乳酸菌，利用产酸、亚硝酸盐降解率等指标筛选出优良的乳酸菌，对其进行鉴定，然后进行耐盐、耐酸能力的比较，通过药敏实验初步考察分离乳酸菌的安全性。本研究将为剁辣椒发酵剂的开发利用提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种、培养基与试剂

自然发酵剁辣椒为食品微生物实验室自制。

MRS培养基：胰蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母浸粉5.0 g、柠檬酸三铵2.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温-80 1.0 mL、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.5 g、硫酸锰0.25 g、琼脂15.0 g、水1 L，pH 6.4；在MRS培养基中分别加入不同终含量的NaCl及NaNO2，用于菌株的特性研究。

药敏片 杭州微生物试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DNP-9272BS-III生化培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司；HH-8数显恒温水浴锅 上海浦东物理光学仪器厂；LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；TGL-20M离心机 长沙英泰仪器有限公司；雷磁pHs-3C pH计 上海精科实业有限公司；1510型全波长酶标仪 赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 剁辣椒中乳酸菌的分离、纯化

称取25 g自然发酵剁辣椒，放置于225 mL无菌生理盐水中，摇匀，制备系列稀释溶液，选取合适稀释度的稀释液，移取0.1 mL涂布于MRS固体平皿中，37 ℃培养24 h。挑取平板表面的单菌落至MRS平板上进行划线纯化，纯化得到的单菌落进行保存。

1.3.2 菌株产酸分析

将纯化后的单菌落接种于5 mL的MRS培养液中，37 ℃培养24 h，利用酶标仪检测菌液在波长600 nm处的光密度值OD600nm，利用pH计测试各菌株发酵液的最终pH值。

1.3.3 菌株亚硝酸盐降解率测定

将在MRS培养液中活化后的菌株，以2%接种量接种于含有150 μg/mL NaNO2的MRS培养液中，37℃培养24 h，测定培养前后培养液中NaNO2含量，计算培养液中亚硝酸盐降解率。

1.3.4 亚硝酸盐含量的测定

采用GB/T 5009.33—2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中盐酸萘乙二胺分光光度法[7]。

1.3.5 筛选菌株的生理生化鉴定

生理生化实验包括：产酸产气实验、精氨酸产氨实验、淀粉水解实验、明胶液化实验、硫化氢实验、碳源利用实验等[8-9]。

1.3.6 分子生物学鉴定

乳酸菌基因组DNA的提取：按照天根生化科技有限（北京）有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。

16S rDNA的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增：PCR扩增引物分别为：正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物1541R：5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’。

引物的合成和PCR产物的测序由华大基因完成。PCR条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30次循环，最后72 ℃延伸10 min。测定后的16S rDNA序列登陆NCBI进行BLAST比对。

1.3.7 筛选菌株的生长曲线

将活化12 h后的菌液按1%的接种量转接至MRS液体培养基中，同时以不接种的MRS液体培养基作为空白对照，于37 ℃恒温培养，分别在2、4、6、8、10、12、24、36、48 h时将培养管取出，测定各菌株的OD600nm值，记录测量结果。以培养时间为横坐标，OD600nm值为纵坐标，绘制各菌株生长曲线。

1.3.8 筛选菌株的耐盐能力比较

将初筛筛选出的乳杆菌活化后分别接种于含6%、9% NaCl的MRS培养液中，37 ℃培养，每隔2 h测定菌液OD600nm值。以培养时间为横坐标，菌液OD600nm为纵坐标，绘制曲线。

1.3.9 筛选菌株的耐酸能力比较

将初筛筛选出的乳杆菌活化后分别接种于pH 3和pH 5的MRS培养液中，37 ℃培养，每隔2 h测定菌液OD600nm值。以培养时间为横坐标，菌液OD600nm为纵坐标，绘制曲线。

1.3.10 药敏实验

采用红霉素（15 μg/片）、四环素（40 μg/片）、庆大霉素（10 μg/片）、青霉素（10 μg/片）、氨苄西林 （10 μg/片）对筛选菌株进行药敏实验（红霉素、氨苄西林、庆大霉素、四环素、青霉素）[10-11]。将活化后的筛选菌株以体积分数2%接种于MRS培养基中，37 ℃培养4～6 h（OD600nm=0.5），取0.1 mL涂布于MRS平板上，取抗生素药片，轻轻置于MRS平板表面。平板置于37 ℃培养12 h，观察抗生素药片周围是否出现抑菌圈。

1.4 数据统计分析

实验数据的统计分析及数据绘图，均采用Origin 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的产酸能力比较

通过镜检与过氧化氢酶实验，共从12 份自然发酵剁辣椒中分离出28 株乳酸菌。通过比较28 株乳酸菌培养24 h发酵液的OD600nm值和pH值，比较不同菌株的生长能力和产酸能力，实验结果如表1所示。

表1 不同菌株的OD600 nm值和pH值比较Table 1 Comparison of OD600 nm and pH values of cultures of 28 isolates

根据表1可知，分离的28 株乳酸菌，通过24 h的培养，OD600nm的范围集中在0.37～1.68，最终pH值的范围集中在4.01～5.56之间，其中W-2、W-4、Y-5、Y-12、Y-14、Y-17、Y-18、Y-25、Y-27、Y-28、Y-29、Y-31这12 株菌的OD600nm值在1.00以上，最终pH值在4.5以下，呈酸性，选择这12 株菌进行亚硝酸盐降解实验。

2.2 亚硝酸盐降解率比较

将初筛后的12 株菌接种至含NaNO2的MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养箱中培养24 h。亚硝酸盐降解率结果见表2。

由表2可知，除了Y-14菌以外，其余复筛的11 株乳酸菌，对于150 mg/L NaNO2的亚硝酸盐降解率都在90%以上，选择降解率在96%以上的W-4、Y-5、Y-12、Y-25、Y-31这5 株菌进行鉴定。

表2 初筛菌株的复筛结果Table 2 Comparison of OD600 nm and pH values of 12 of the 28 isolates

2.3 分离菌株的鉴定

表3 分离菌株的发酵特性Table 3 Fermentation characteristics of 5 selected strains

参考《伯杰细菌手册》和《常见细菌系统鉴定手册》[12-13]，结合表3结果，初步鉴定分离菌株Y-5、Y-12、W-4与植物乳杆菌（L. plantarum）鉴定特征接近，分离菌株Y-25和Y-31与短乳杆菌（L. brevis）鉴定特征相接近。

分别提取Y-5、Y-12、Y-25、Y-31、W-4的基因组DNA后，用16S rDNA通用引物进行PCR扩增，扩增得到的片段大小在1.5 kb左右（图1）。

将PCR产物进行测序，测序结果登录NCBI网站，进行BLAST序列比对，发现Y-5、Y-12、W-4与植物乳杆菌的16S rDNA同源性达99%以上（图2），结合生理生化实验的结果，可判定Y-5、Y-12、W-4这3 株菌为植物乳杆菌。Y-25、Y-31的16S rDNA序列与短乳杆菌的同源性达99%以上，结合生理生化实验结果，可以判定Y-25、Y-31为短乳杆菌。

图1 16S rDNA扩增结果Fig. 1 PCR amplification of 16S rDNA

图2 基于筛选菌株16S rDNA序列构建的系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of isolated strains

2.4 乳杆菌的生长曲线

图3 分离菌株的生长曲线Fig. 3 Growth curves of five isolated strains

将W-4、Y-5、Y-12、Y-25、Y-31这5 株菌活化后转接至MRS液体培养基中，于37 ℃恒温培养。由图3可以看出，5 株菌的生长情况基本相似。在培养至约6 h时进入对数生长期，在15 h时进入平台期。

2.5 乳杆菌耐盐能力比较

将W-4、Y-5、Y-12、Y-25、Y-31这5 株菌活化后转接至含盐量分别为6%、9%的MRS液体培养基中，于37 ℃恒温培养。

图4 分离菌株在6% NaCl胁迫下的生长情况Fig. 4 Growth curves of five strains under osmotic stress with 6% NaCl

从图4可以看出，在6% NaCl的渗透压胁迫下，5 株菌的生长均出现不同程度的抑制。W-4、Y-5、Y-12这3 株植物乳杆菌，在培养3 h后相继进入对数生长期，较图3中生长曲线提早进入对数生长期，可能的原因是接种时所用的活化菌株不是处于同一生长阶段，致使生长延迟期不一致，但渗透压胁迫下的对数生长期细胞增长数量明显低于正常状态下生长数量。Y-25、Y-31这两株短乳杆菌在前12 h内基本没有生长，培养24 h后OD600nm值才达到0.8左右。

图5 分离菌株在9% NaCl胁迫下的生长情况Fig. 5 Growth curves of five strains under osmotic stress with 9% NaCl

从图5可看出，9% NaCl的渗透压胁迫下，植物乳杆菌W-4在培养6 h后进入对数生长期，其他4株乳酸菌在培养的12 h内基本没有生长，而短乳杆菌在培养24 h后OD600nm值基本没有变化，说明短乳杆菌的生长受到强烈抑制。由此可见，植物乳杆菌相比较于短乳杆菌，具有更强的抗渗透压胁迫能力，其中植物乳杆菌W-4的抗渗透压能力最强。

2.6 乳杆菌耐酸能力比较

将W-4、Y-5、Y-12、Y-25、Y-31这5 株菌活化后分别转接至pH 3和pH 5的MRS液体培养基中，于37 ℃恒温培养。从图6可以看出，在pH 5条件下，5 株菌的生长情况基本一样，在培养至6 h时进入对数生长期，而在培养12 h时，W-4、Y-5、Y-31这3 株菌的OD600nm值已经高于另外两株菌。在培养24 h后，5 株菌的OD600nm值基本接近，在1.5左右。

图6 分离菌株在pH 5酸性胁迫下的生长情况Fig. 6 Growth curves of 5 strains under acidic stress with pH 5

而在pH 3条件下，5 株菌的生长受到明显的抑制，没有明显的对数生长期，生长较为缓慢（图7）。相比较其他菌株，植物乳杆菌W-4的生长受到的抑制作用最小。

图7 分离菌株在pH 3酸性胁迫下的生长情况Fig. 7 Growth curves of 5 strains under acidic stress with pH 3

2.7 乳杆菌药敏实验结果

药敏实验证实W-4、Y-5、Y-12、Y-25、Y-31这5 株菌对测试的5 种抗生素均敏感，图8为W-4药敏实验的结果，出现抑菌圈说明该菌株对测试的5 种抗生素敏感。

图8 植物乳杆菌W-4对抗生素的敏感性Fig. 8 Antibiotic susceptibility of L. plantarum W-4

3 讨 论

辣椒是世界上消费量最大的蔬菜之一，而且辣椒富含VC、多酚、黄酮、辣椒素等活性成分，因此具有很强的抗氧化能力[14-16]。剁辣椒品质的形成与乳酸菌的作用密不可分。本研究从自然发酵剁辣椒中分离出乳酸菌，利用产酸、亚硝酸盐降解率等指标筛选出优良的乳酸菌，经生理生化与分子生物学鉴定，分离菌株为植物乳杆菌和短乳杆菌，这与前人的研究结果一致。

植物乳杆菌是一种适应能力较强的乳酸菌，在很多发酵食品中都有它的身影。如乳制品、发酵蔬菜、发酵肉制品等，而且植物乳杆菌在人和动物的肠道中也能进行定殖[17-18]。植物乳杆菌常见于发酵黄瓜、番茄、茄子等果蔬中[19-21]，其中有一些植物乳杆菌具有较强的亚硝酸盐降解能力[22]。耐盐能力对于植物乳杆菌在高盐条件下进行发酵具有重要的意义，决定着植物乳杆菌能否快速成为发酵过程中的优势菌[23-24]。本研究证实植物乳杆菌比短乳杆菌具有更强的耐胁迫能力，这与植物乳杆菌具有强大的环境适应能力有关，例如植物乳杆菌具有较多的植物多酚降解基因[25-26]，同时植物乳杆菌具有过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶等合成能力，具有较强的抵御不良环境能力[27-28]。在蔬菜自然发酵过程中，主要利用蔬菜表面附着的乳酸菌启动乳酸发酵的过程，这些来源于环境中乳酸菌的安全性也受到了关注，有研究报道指出泡菜原料表面多种乳酸菌对抗生素存在一定的抗性[29-30]。而植物乳杆菌是一致公认为安全的乳酸菌，国家卫生部明文规定可以添加在食品中，下一步工作将研究植物乳杆菌接种发酵剁辣椒的工艺，以及进一步阐明植物乳杆菌在剁辣椒品质形成中的作用机制。

参考文献：

[1]CAGNO R D, CODA R, DE ANGELIS M, et al. Exploitation of vegetables and fruits through lactic acid fermentation[J]. Food Microbiology, 2013, 33(1): 1-10. DOI:10.1016/j.fm.2012.09.003.

[2]赵玲艳, 邓放明, 杨抚林, 等. 自然发酵辣椒中乳酸菌的分离及其发酵性能研究[J]. 食品科学, 2005, 26(10): 82-86. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2005.10.014.

[3]钟燕青. 自然发酵辣椒中乳酸菌分离筛选及香气成分分析[D].长沙: 湖南农业大学, 2012.

[4]王兰, 赵玲艳, 陈思思, 等. 发酵辣椒中产亚硝酸盐还原酶短乳杆菌L5的选育及特性研究[J]. 中国酿造, 2014, 33(11): 25-29.DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.006.

[5]王丽芳, 王修俊, 郑君花, 等. 发酵辣椒中一株乳酸菌的分离鉴定及其生长特性的研究[J]. 中国调味品, 2014, 39(6): 67-72.DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2014.06.016.

[6]王修俊, 王丽芳, 郑君花, 等. 贵州发酵辣椒中优良乳酸菌的分离鉴定及生长特性研究[J]. 食品科技, 2014, 39(10): 17-21.

[7]卫生部. 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定: GB/T 5009.33—2010[S].北京: 中国标准出版社, 2010: 4-9.

[8]东秀珠, 蔡妙瑛. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社,2001.

[9]沈萍, 范秀容, 李广武. 微生物学实验[M]. 北京: 高等教育出版社, 1999.

[10]LIU G R, GRIFFITHS M W, WU P P, et al. Enterococcus faecium LM-2, a multi-bacteriocinogenic strain naturally occurring in “Byaslag”, a traditional cheese of Inner Mongolia in China[J]. Food Control, 2011,22(2): 283-289. DOI:10.1016/j.foodcont.2010.07.023.

[11]ZHOU H, HU Y M, JIANG L W, et al. Antilisterial activity of bacteriocin HY07 from Enterococcus faecium HY07 isolated from Chinese sausages[J]. Food Biotechnology, 2015, 29(1): 51-68.DOI:10.1080/08905436.2014.996893.

[12]BUCHANA R E, GIBBONS N E. 伯杰细菌鉴定手册[M]. 8版.北京: 科学出版社, 1984: 797-815.

[13]凌代文. 乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1999: 6-16.

[14]NAMIKI M. Antioxidants/antimutagenes in food[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1990, 29(4): 273-300.DOI:10.1080/10408399009527528.

[15]MATEOS R M, LEÓN A M, SANDALIO L M, et al. Peroxisomes from peppers fruits (Capsicum annum L.): purification, characterization and antioxidant activity[J]. Journal of Plant Physiology, 2003, 160:1507-1516. DOI:10.1078/0176-1617-01008.

[16]DEEP A N, KAUR C, BINOY G, et al. Antioxidant constituents in some sweet pepper (Capsicum annum L.) genotypes during maturity[J]. LWT-Food Science and Technology, 2007, 40: 121-129.DOI:10.1016/j.lwt.2005.09.016.

[17]UPADRASTA A, STANTON C, HILL C, et al. Stress responses of lactic acid bacteria[M]. Springer US, 2011: 219-249.

[18]CHIBANNI-CHENNOUFI S, DILLMANN M L, MARVIN-GUY L,et al. Lactobacillus plantarum bacteriophage LP65: a new member of the SP01-like genus of the Family Myoviridae[J]. Journal of Bacteriology,2004, 186: 7069-7083. DOI:10.1128/JB.186.21.7069-7083.2004.

[19]DI CAGNO R, SURICO R F, MINERVINI G, et al. Use of autochthonous starters to ferment red and yellow peppers (Capsicum annum L.) to be stored at room temperature[J]. International Journal of Food Microbiology, 2009, 130: 108-116. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2009.01.019.

[20]SESEÑA S, PALOP M L. An ecological study of lactic acid bacteria from Almagro eggplants fermentation brines[J]. Journal of Applied Microbiology,2007, 103: 1553-1561. DOI:10.1111/j.1365-2672.2007.03387.x.

[21]XIONG T, SONG S H, HUANG X H, et al. Screening and identification of functional Lactobacillus specific for vegetable fermentation[J]. Journal of Food Science, 2013, 78(1): M84-M89.DOI:10.1111/j.1750-3841.2012.03003.x.

[22]YAN P M, XUE W T, TAN S S, et al. Effect of inoculating lactic acid bacteria starter cultures on the nitrite concentration of fermenting Chinese paocai[J]. Food Control, 2008, 19: 50-55. DOI:10.1016/j.foodcont.2007.02.008.

[23]CHAMKHA M, SAYADI S, BRU V, et al. Microbiol diversity in Tunisian olive fermentation brine as evaluated by small subunit rRNA-single strand conformation polymorphism analysis[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 122: 211-215. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2007.11.052.

[24]MILESI M, Mc SWEENEY P, HYNES E. Viability and contribution to proteolysis of an adjunct culture of Lactobacillus plantarum in two model cheese systems: cheddar cheese-type and soft-cheese type[J].Journal of Applied Microbiology, 2008, 105: 884-892. DOI:10.1111/j.1365-2672.2008.03813.x.

[25]ESTEBAN-TORRES M, LANDETE J M, REVERÓN I, et al. A Lactobacillus plantarum esterase active on a broad range of phenolic esters[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2015, 81(9):3235-3242. DOI:10.1128/AEM.00323-15.

[26]JIMÉNEZ N, ESTEBAN-TORRES M, MANCHEÑO J M, et al.Tannin degradation by a novel tannase enzyme present in some Lactobacillus plantarum strains[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(10): 2991-2997. DOI:10.1128/AEM.00324-14.

[27]BROOIJMANS R J W, VOS W M D, HUGENHOLTZ J. Lactobacillus plantarum WCFS1 electron transport chains[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(11): 3580-3585. DOI:10.1128/AEM.00147-09.

[28]WATANABE M, VEEN S V D, ABEE T. Impact of respiration on resistance of Lactobacillus plantarum WCFS1 to acid stress[J].Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(11): 4062-4064.DOI:10.1128/AEM.00287-12.

[29]蔡婷, 徐顾榕, 林凯, 等. 发酵用鲜辣椒中乳酸菌抗生素耐药性与耐药基因[J]. 食品与生物技术学报, 2016, 35(9): 941-949.DOI:10.3969/j.issn.1673-1689.2016.09.007.

[30]蔡婷, 卢倩文, 向文良, 等. 四川泡菜发酵原料-灯笼辣椒附生乳酸菌的抗生素耐药性评估与耐药基因分析[J]. 食品科学, 2017, 38(2):27-33. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702005.