硅胶柱层析分离天然产物实验要点分析

刘延杰 陈弯弯 向碧云 朱旭东 郝晓冉

（北京师范大学生命科学学院 北京 100875）

从天然产物中提取、分离和表征生物小分子，是新药研发中获得先导化合物的主要途径之一。层析法（Chromatography）是天然产物分离最常用的方法之一。层析法最早是根据化合物颜色分离一些植物色素，如今，层析法已经演变成为一种高度敏感的、有效的化合物分离和鉴定方法［1-8］。柱层析一般包括常压柱层析、中压柱层析和高压柱层析。按照柱填料又可分为硅胶柱层析（Silica gel column chromatography）、离子交换层析（Ionexchange chromatography，IEC）、凝胶渗透色谱（Gel-permeation /molecular sieve chromatography，GPC）、疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatography，HIC）等［9］，其中以硅胶柱层析（正／反相）使用最为广泛。与其他层析方法相比，柱层析具有操作简单，经济实惠，样品承载量大等优点，是天然产物分离纯化的首选方法之一［10-12］。

硅胶柱层析分为正相硅胶柱层析和反向硅胶柱层析2 种，正相硅胶柱层析填料为正相硅胶，适合分离相对极性较小的化合物，例如各类苷元；所以通常选用极性较小的有机溶剂作为洗脱剂，例如石油醚-二氯甲烷洗脱系统，氯仿-乙酸乙酯洗脱系统等。反向硅胶柱层析使用的是反相硅胶，适合分离极性相对较大的化合物，例如生物碱等各类苷类，常采用甲醇-水，乙腈-水不同比例作为洗脱剂。

硅胶柱层析在上样时，常分为干法上样和湿法上样。干法上样将待分离物质溶解后拌在少量硅胶G 中，待挥发至干后填入装好的硅胶柱中，再加层析液进行洗脱。湿法上样先将硅胶G 用洗脱液溶胀后装入硅胶柱，再将溶解好的样品倒入硅胶柱进行分离。这2 种方法对物质分离效果差别不大，湿法上样操作简单便捷，但溶解样品最好用二氯甲烷、乙酸乙酯等极性较小的溶剂，对于一些溶解度小的物质，宜使用干法上样。本文以常压正相硅胶柱的干法上样为例，对小孢拟盘多毛孢红薯渣发酵产物二氯甲烷粗提物进行初步分离。

1 材料和方法

1.1 实验材料 二氯甲烷相粗提物约1 g；100～200 目硅胶G 约100 g （青岛海洋化工厂分厂）；内径×柱高=2.5 cm×40 cm 玻璃柱；Si60 F254 TLC 薄层层析板（默克化工技术有限公司）；0.3 mm 毛细管。10%硫酸乙醇显色液；二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇（分析级，北京蓝弋化工产品有限责任公司）。

1.2 层析液比例确定 由于TLC 法操作简单，且层析原理与硅胶柱层析一致，所以确定硅胶柱层析层析条件时一般用TLC 探索条件。TLC 法分为正相TLC 和反向TLC 2 种。由于硅胶柱层析可以近似地看作TLC 板多次展开系统，样品洗脱速率要比TLC 板上展开速率快，所以一般选用Rf值为0.3～0.5 的层析液进行硅胶柱层析。

具体操作方法如下：

1）用玻璃刀将现成的TLC 板裁成2 cm×8 cm左右小板，用毛细管将稀释后适当浓度的粗提物样品点在离TLC 板短边缘1 cm 处正中央。注意样品点尽可能小，可及时用吹风机冷风吹干。

2）选择二氯甲烷∶乙酸乙酯=1∶0，9∶1，1∶1 和0∶1 对样品进行TLC 展开，待层析液跑至上边缘0.5 cm 处停止展开，用吹风机吹干硅胶板上的有机试剂。

3）将展开好的TLC 板用硫酸乙醇液显色后观察（图1），目标物质的Rf 值分别为0.15，0.5，0.8和0.9，选取Rf=0.3-0.5 的层析液作为硅胶柱层析的层析液，所以选择二氯甲烷∶乙酸乙酯=9∶1 为柱层析层析液。

若不确定待分离样品极性，可按照有机溶剂极表从小到大依次尝试摸索极性。常用的溶剂极性从小到大依次为： 石油醚＜环己烷＜苯＜二氯甲烷＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水。选择层析液极性越大，样品点越接近溶剂前沿；极性越小，样品点越接近原点。单一溶剂一般达不到层析要求，通常选择2 种或3 种溶剂混合使用，还要考虑到溶剂间的溶解度问题。常见的混合溶剂组合有：石油醚/乙酸乙酯，石油醚/丙酮，二氯甲烷/乙酸乙酯，二氯甲烷/甲醇，乙酸乙酯/甲醇等。

1.3 拌样 拌样是硅胶柱层析干法上样的一个重要环节。拌样所用的硅胶G 的量要合适，一般以样品质量∶硅胶G 质量=1∶3 为宜。若硅胶G 过多，则柱层析样品层过厚，各个组分容易发生交错重叠；若硅胶G 过少，则样品不能完全吸附在硅胶G 中，使样品损失严重。此外，拌样不均匀也是影响实验结果的重要因素。

具体方法如下：

1）称取1 g 粗提物，按照粗提物质量∶硅胶G质量=1∶3 称取3 g 硅胶G 于蒸发皿中。

2）将样品用有机试剂完全溶解，在通风厨中吸取少量样品滴加到硅胶G 中，用药勺将样品搅拌均匀，待样品挥发至干后继续滴加样品，直至将样品全部拌入硅胶G 中。期间不断用药勺搅拌硅胶G 防止拌样不均匀。

3）将挥发干的硅胶G 在通风厨中放置过夜，使有机试剂完全挥发。

1.4 装柱 装柱是硅胶柱层析最重要的环节，柱子质量直接决定样品的分离效果和得率。首先，保证柱身竖直，否则洗脱时样品条带会呈倾斜，严重时洗脱产物不纯，需要重新纯化。其次，硅胶G 要压实，不能留有气泡，否则样品条带会呈弥散型，影响分离效果。具体步骤如下：

1）将玻璃柱竖直架于铁架台上。

2）按照质量比样品∶硅胶G=1∶40 称取硅胶G 40 g。将硅胶G 倒入硅胶柱内，拍打柱身使硅胶粉压实，期间不断旋转柱体，使硅胶G 填充均匀。

3）将拌好样的硅胶G 倒入硅胶柱内，同样拍打柱身并不断旋转柱体，使样品层均匀。

4）在样品层上铺一层约0.5 cm 厚的硅胶G，防止加层析液时样品层飞溅。

1.5 样品接收 配制3 倍柱体积的层析液，超声10 min。打开玻璃柱阀门，缓慢将层析液倾倒入硅胶柱内至满。选择合适大小的试管接收流出液，一般10～20 mL/管为宜，流速1 mL/min，过快样品拖尾严重，过慢则样品条带弥散。

如果目标产物与杂质极性相差不大，可以采用梯度层析系统。梯度层析又称梯度洗脱，是指用不同极性洗脱剂分别对样品进行洗脱，达到分离的效果。正相硅胶柱层析如需要梯度层析，则按照层析液极性由小到大依次倒入物质硅胶柱内。注意层析液极性差别不应过大，且换层析液极性前，尽可能将硅胶上方的层析液流尽。

1.6 检测与合并 以20 mL/管收集流出液，共收集10 管，分别对这10 管流出液进行TLC 检测，展开剂为二氯甲烷∶乙酸乙酯=9∶1（图3）。合并1～4 管，5～7 管，8～10 管，旋蒸至干计算样品质量，分别为7 mg，10 mg 和4 mg。分别转移至EP管中，编号样品1、2、3，-20℃保存。

合并时如果样品量足够，为了保证纯度，可以弃去纯度不高的接收液；如果样品量少，不足以进行之后的产物鉴定实验，要将所有含有目标物质的接收液合并，并进一步纯化。

2 硅胶柱层析注意事项及常见问题解决

1）检查硅胶柱阀门是否泄漏。一是玻璃柱使用前，首先检查气密性，保证阀门完好不漏液；二是将硅胶G 装入硅胶柱后，先打开硅胶柱阀门检查是否有硅胶漏出，并不断拍打柱身，使硅胶柱装填均匀。三是在洗脱过程中关注阀门处是否有液体渗出。

2）在用洗脱液进行洗脱时，防止洗脱液流干。硅胶柱层析是一个持续洗脱的过程，期间应该保证样品一直处于洗脱状态。如果洗脱液流干后再补加洗脱液，则会在柱子中残留气泡影响分离效果。

3）硅胶柱出现裂缝。层析液流干或者装柱时硅胶G 不均匀都可能造成硅胶柱出现裂缝。如果目标物质已被冲到裂缝下方，对分离效果影响较小，可以继续用洗脱液洗脱；如果裂缝较大，严重影响分离效果，可用甲醇将所有样品全部冲下，蒸发浓缩后再次柱层析。

4）回收产物成分仍然很复杂。如果各个组分之间极性差别较大，可能是洗脱液极性偏大，可以适当减小洗脱液极性或者选择10 mL/管或者更小体积接收洗脱液；如果各组分之间极性差别较小，可以通过适当降低流速改善，也可以选择制备成硅胶板或者葡聚糖凝胶柱等其他纯化方式进一步纯化。

3 结论

常压硅胶柱层析操作简单、廉价，且载样量大，因而常用于分离纯化天然产物。本文以1 g 粗品的开放性硅胶柱分离为例，通过干法上样，TLC检测后合并流出液，将3 种不同物质初步分离。实验结果显示，通过开放性硅胶柱层析能够很好地将极性不同的物质分离。工业上一般应用多次硅胶柱层析纯化，或者将硅胶柱层析与分子筛、离子交换层析等其他分离纯化方法结合，以取得更好的纯化效果。