HPLC-ELSD测定磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱含量的方法研究

王小宾，张秉华，杨树民，高玉琼，郭利影，杨广德*

(1.西安交通大学药学院，西安 710061； 2.陕西省食品药品检验所，西安 710065；3.河北医科大学第一医院，石家庄 050031)

磷脂酰丝氨酸[1-2]又称丝氨酸磷脂、二酰甘油酰磷酸丝氨酸或复合神经酸(phosphatidylserine，PS)，一般由天然大豆榨油剩余物提取。由于其具有很强的亲脂性，吸收后能够迅速通过血脑屏障进入大脑，起到舒缓血管平滑肌细胞、增加脑部供血的作用[3-4]。2010年根据《中华人民共和国食品安全法》和《新资源食品管理办法》的规定，磷脂酰丝氨酸被批准为新资源食品，并对其含量规定为50.0%～60.0%[5]。欧盟批准磷脂酰丝氨酸用于酸奶、巧克力等食品。磷脂酰丝氨酸的制备方法较多，以提取法和酶转化法为主，提取法主要是从植物细胞和动物的卵磷脂中提取磷脂酰丝氨酸[6-12]。

磷脂酰胆碱(phosphatidyl choline, PC)是一种两性分子，由亲水的头部和疏水的尾部组成，亦称卵磷脂。磷脂酰胆碱在蛋黄和大豆中特别丰富，在食品行业中广泛用作乳化剂。工业用磷脂酰胆碱主要是作为大豆油精炼过程中的副产品获得[13]。溶血磷脂酰胆碱(lyso-phosphatidyl choline，L-PC)是磷脂的降解产物，由于最常用的磷脂类化合物为卵磷脂，因而溶血磷脂一般是指溶血卵磷脂。

目前，对磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱的检测有核磁共振和薄层色谱，使用最多的是HPLC法，应用检测器为紫外检测器或蒸发光检测器，对复杂、体内和多组分样品主要用蒸发光检测器(ELSD)[14-26]。由于合成反应过程中，通常需要检测反应的进行程度以及合成物的纯度，关于磷酯酰丝氨酸和磷脂酰胆碱同时测定方法却未见报道。参考有关文献，制定HPLC-ELSD方法，对磷酯酰丝氨酸的含量及其残留的合成原料磷脂酰胆碱的含量同时进行有效的控制，解决磷酯酰丝氨酸含量测定的实际问题。

1 仪器与试药

1.1仪器 Alliance HT色谱系统(美国Waters 公司)；Empower 色谱管理软件(美国Waters 公司)；Alltech 3300 ELSD 蒸发光检测器(美国格雷斯公司)；色谱柱：LiChrospher 100 Diol (100 mm×4.6 mm, 5 μm);CPA225D型十万分之一电子天平(沈阳神宇龙腾天平有限公司)；KQ5200B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；Millipore超纯水机(美国Millipore公司)。

1.2试药 磷脂酰丝氨酸对照品(购自SIGMA公司，批号1001498227，质量分数≥97%)；磷脂酰胆碱对照品(购自SIGMA公司，批号0691K521，质量分数≥99%)；磷脂酰胆碱原料(北京美亚斯磷脂技术有限公司，批号20120416)；磷酯酰丝氨酸样品及半成品(均为实验室自制)；正己烷(色谱纯，TEDIA公司)；异丙醇(色谱纯，SIGMA公司)；三乙胺(色谱纯，CNW公司)；冰醋酸、三氯甲烷(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；水为经Millipore纯水机处理过的超纯水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 采用LiChrospher 100 Diol色谱柱 (100 mm×4.6 mm, 5 μm)。流动相A为正己烷-异丙醇-冰醋酸-三乙胺(825∶170∶5∶0.8)及流动相B异丙醇-水-冰醋酸-三乙胺(845∶150∶5∶0.8)，梯度洗脱：0～5 min：5%～20%B；5～8.5 min：20%～40%B；8.5～15 min：40%～100%B；15～17.5 min：100%B；17.5～20 min：100%～5%B；20～25 min：5%B。流速为1.0 mL·min-1；进样量：20 μL；检测器漂移管温度：85 ℃；气体流速：2.5 L·min-1；柱温：35 ℃。

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液 分别精密称取磷脂酰丝氨酸对照品和磷脂酰胆碱试药19.95和20.03 mg，置于同一25 mL量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度均为0.8 mg·mL-1磷酯酰丝氨酸和磷脂酰胆碱混合对照溶液。

2.2.2供试品溶液 分别精密称取同一批号磷脂酰胆碱合成磷酯酰丝氨酸过程样品20 mg，精密称定，置于25 mL量瓶中，加入20 mL三氯甲烷超声溶解，冷却至室温，用三氯甲烷稀释至刻度，0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。在反应开始及反应完成后，测定磷酯酰丝氨酸或磷脂酰胆碱含量时，取样200 mg，精密称定，置于25 mL量瓶中，加入20 mL三氯甲烷超声溶解，冷却至室温，用三氯甲烷稀释至刻度，0.45 μm微孔滤膜滤过，备用。

2.3系统适用性实验 分别吸取2.2项下制备的混合对照品溶液、空白溶剂以及供试品溶液，按照2.1项下色谱条件，分别进样20 μL，记录色谱图。结果表明，在此色谱条件下，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱分离良好，理论塔板数按照磷脂酰丝氨酸峰计算一般不低于5 000，磷脂酰丝氨酸色谱峰和磷脂酰胆碱色谱峰分离度应不小于2.5，拖尾因子在0.95～1.05之间，空白溶液不干扰测定。色谱图见图1。

图1HPLC图

A.对照品；B.供试品；C.磷脂酰丝氨酸半成品；D.空白溶剂；1.磷脂酰胆碱；2.磷酯酰丝氨酸。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference;B.sample；C.mid-product of phosphatidylserine; D.solvent;1.phosphatidyl cholines;2.phosphatidylserine.

2.4线性关系考察 量取2.2.1项下制备的混合对照溶液7.5，5，5和2.5 mL，分别置于10，10，20和20 mL量瓶中，用三氯甲烷稀释至刻度，摇匀。制成含磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱分别均为0.1，0.2，0.4，0.6和0.8 mg·mL-1的线性系列溶液。精密量取各质量浓度线性系列溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液质量浓度对数(mg·mL-1)为横坐标(x)、峰面积的对数为纵坐标(y)，分别绘制标准曲线，磷脂酰胆碱线性方程为：y=176.2x+0.088，r=0.999 8；磷脂酰丝氨酸线性方程为：y=183.5x+0.032 9，r=0.999 6。实验结果表明，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱在质量浓度在0.1～0.8 mg·mL-1与峰面积线性关系良好。

2.5精密度实验 精密吸取2.4项下制备的对照品溶液中磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱质量浓度均为0.4 mg·mL-1的溶液20 μL，连续进样6次，测定磷脂酰丝氨酸色谱峰和磷脂酰胆碱色谱峰的峰面积，RSD值分别为0.9%和1.3%。结果表明，该方法精密度良好。

2.6重复性实验 取同一批号样品按照2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，采用外标法计算供试品含量。结果磷脂酰丝氨酸的平均含量为52.83%，RSD值为0.45%；磷脂酰胆碱的平均含量为2.37%，RSD值为0.86%。

2.7稳定性实验 精密吸取2.4项下对照溶液中磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱质量浓度均为0.4 mg·mL-1的溶液，分别于0，2，4，6，8和10 h进样20 μL，测定不同时间磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱色谱峰峰面积，其RSD值分别为1.35%和1.53%。结果表明，磷酯酰丝氨酸和磷脂酰胆碱的三氯甲烷溶液在10 h内基本稳定。

2.8检测限与定量限 取稳定性实验中磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱质量浓度均为0.4 mg·mL-1的溶液适量，用三氯甲烷稀释至待测组分峰高为基线噪音的3和10倍，记录色谱图。实验结果表明，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱的检测限分别为0.02和0.021 mg·mL-1,定量限分别为0.07和0.05 mg·mL-1。

2.9耐用性 在2.1项色谱条件下，选用不同的高效液相色谱仪和蒸发光检测器(安捷伦1260液相色谱仪，Alltech ELSD 2000蒸发光检测器)，流速选用0.9 mL·min-1；检测器漂移管温度：90 ℃；气体流速：2.0 L·min-1；柱温：30℃进行测定，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱色谱峰仍能达到有效分离，色谱峰分离度为3.2，溶剂无干扰，测定结果良好。

2.10加样回收实验 精密称取已知含量的同一半成品(磷脂酰胆碱含量为2.37%，磷酯酰丝氨酸含量为52.83%)9份，置于25 mL量瓶中，依照2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别加入磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸，按照低、中、高 3 个质量浓度水平，进行方法的准确度实验，加样回收率为 91.9%～98.4%，测定RSD值均小于2.5%，该方法具有良好的准确度。结果见表1和表2。

表1磷脂酰丝氨酸的加样回收实验结果

Tab.1 Results of recovery of phosphatidylserine

取样量/g样品含量/mg对照品加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%0．00995．23744．25009．364697．1196．402．310．01005．29554．25009．395596．470．00965．04994．25009．214597．990．01065．59935．300010．804498．210．00975．12325．300010．234096．430．01075．64035．300010．582093．240．01105．80216．400012．100998．420．00985．20056．400011．082191．900．01055．54726．400011．809697．85

表2磷脂酰胆碱的加样回收实验结果

Tab.2 Results of recovery of phosphatidyl cholines

取样量/g样品含量/mg对照品加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%0．11332．68402．00004．632497．4296．581．550．10872．57622．00004．459494．160．10522．49322．00004．461498．410．10472．48022．50004．906797．060．10932．59042．50005．045798．210．10242．42572．50004．819495．750．10332．44703．00005．336996．330．10162．40793．00005．239194．370．10522．49323．00005．418497．51

2.11样品测定结果 分别精密吸取2.2项下制备的对照品溶液和供试品溶液各20 μL，依照2.1项下色谱条件进样测定，采用外标法分别计算磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱的含量，结果其平均含量分别为53.87%和2.15%。

3 讨论

由于磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱极性较大、相对分子质量大，选择正相LiChrospher 100 Diol (100 mm×4.6 mm, 5 μm)色谱柱进行洗脱分离、蒸发光散射检测器测定。本文方法分离效果好、专属性强，可准确地监测用磷脂酰胆碱合成磷脂酰丝氨酸过程，也可用于磷脂酰丝氨酸的质量控制。

实验过程中发现，由于溶剂选用三氯甲烷，故磷脂酰丝氨酸或磷脂酰胆碱中水分的大小对最终配制溶液的稳定性影响较大，若磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱的水分含量超过3%时，选用三氯甲烷配制的溶液会明显发生浑浊，在此状态下，若放置时间稍长，溶液会发生沉降现象，若不重新摇匀直接测定会发现含量有明显降低。同时上述不澄清的溶液若通过滤膜滤过后，含量也会有明显下降。通过查阅文献，将溶剂更换为正己烷、异丙醇或不同比例的正己烷-异丙醇混合溶液，均有此现象产生，且最终溶液的状态均没有三氯甲烷作溶剂的溶液整体状态好，故最终选择三氯甲烷为溶剂。磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱进行含量测定前，应首先对其水分进行控制。

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