酱油曲发酵鱼露工艺的研究

2018-05-17李河李建科

中国调味品 2018年5期

李河,李建科

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，西安 710119)

鱼露在我国也称为鱼酱油，早在春秋战国时期已有记载，是我国广东、福建等地及东南亚等国家和地区喜食的调味品之一，具有独特的风味，在这些国家和地区也有较大规模的生产。在不同的国家和地区，使用的原料和生产工艺也各不相同，本研究所制鱼露利用在鱼制品生产中废弃的鱼头、鱼骨、内脏、皮和尾等淡水鱼下脚料，它们总量约占全鱼的40%～55%[1]。若处理不当，不但对环境造成严重破坏，并且还使大量的宝贵资源得不到充分利用。如在鱿鱼内脏中含有20%～30%的粗脂肪，对其脂肪酸成分进行气相色谱分析表明：不饱和脂肪酸占86%，ω系列脂肪酸占37%，其中EPA占12%，DHA占24%[2]。鲢鱼鱼头、鱼皮和鱼骨刺混合物中蛋白质含量达14%，油脂为9.22%；鳗鱼骨、鳗鱼头等废弃物中含有丰富的蛋白质、磷脂质、软骨素和维生素等[3]。因此，将鱼类下脚料充分利用，制成营养价值高的附加产品，不仅可以提高经济效益，还对自然环境的保护起到积极作用。

前期研究结果表明低盐淡水鱼露发酵的最佳条件为：加水比0.5∶1、食盐8%、酱油曲20%。将发酵混合物装入容器中封口后，置于40 ℃恒温培养箱，每天搅拌1次，发酵时间为30天，此时其已经产生鱼露的酱香风味[4-8]。将发酵成熟的鱼露于90 ℃灭菌20 min，冷却至室温后于5000 r/min离心25 min，取澄清液再经滤纸过滤后，即得到鱼露样品。本研究从发酵的第1日算起，在发酵过程中的第1，5，10，15，20，25，30天进行定期取样测定，测定的指标为氨基酸态氮、总酸、盐、挥发性盐基氮、无盐固形物、总氮含量、非酶褐变指数和pH值共8项，对所得数据进行处理，并对其变化进行分析[9-12]。

1 实验材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

淡水鱼下脚料：包括鱼头、鱼尾、鱼骨、内脏等；甲醛溶液：体积百分数为36%；0.05 mol/L氢氧化钠标准溶液(将0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液准确稀释1倍)；此外，还有许多指示液等物品。

0.100 mol/L硝酸银标准滴定溶液：取硝酸银固体17.5 g，加入少量水使其完全溶解，定容至1000 mL，混合均匀，避光存放。

淀粉指示液：称取0.5 g可溶性淀粉，加少量水，搅拌均匀后慢慢倒入100 mL沸水中，边倒边搅拌，煮沸2 min，凉至室温以备用。此指示液应临时配制。

荧光黄指示液：取0.5 g荧光黄固体，加入乙醇溶液使其完全溶解后稀释至100 mL。

50 g/L铬酸钾溶液：取5 g铬酸钾固体用少量水完全溶解后定容至100 mL。

0.6 mol/L高氯酸：量取50 mL高氯酸后加水定容至1000 mL，摇匀。

30 g/L氢氧化钠溶液：加入适量水溶解于30 g氢氧化钠中，放至室温后加水至1000 mL。

0.01 mol/L盐酸标准溶液：量取浓盐酸0.85 mL定容至1000 mL后摇匀。

30 g/L硼酸吸收液：在1000 mL水中加入30 g硼酸使其完全溶解。

10 g/L酚酞指示剂：量取1 g酚酞指示剂在100 mL的95%的乙醇中完全溶解。

混合指示剂：将1份2 g/L甲基红乙醇溶液与1份1 g/L甲基蓝乙醇溶液临用时混合。

混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液配合，临时混用。

混合试剂：1份硫酸铜与3份硫酸钾混合。

95%～98%浓硫酸。

2%硼酸溶液：称取2 g硼酸，加水溶解定容至100 mL。

40%氢氧化钠溶液：称取40 g氢氧化钠，溶于60 mL水中。

0.1 mol/L盐酸标准滴定溶液：按GB/T 601-2016规定的方法配制和标定。

1.1.2 仪器

SPX-100B-Z型生化培养箱上海博讯实业有限公司；UV-1100型紫外可见分光光度计天美(中国)科学仪器有限公司；TDL-5A型低速自动平衡离心机金坛市水北创兴仪器厂；电子天平赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；79HW-1型恒温磁力拌器、 HH-4型数显恒温水浴锅江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 氨基酸态氮的测定(甲醛滴定法)

取样品(鱼露)5.0 mL放入100 mL容量瓶后定容，混合均匀后取20.0 mL，加入60.0 mL水，将玻璃电极和甘汞电极插入样品中后启动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准液滴定至pH为8.2。

加入10.0 mL甲醛溶液后用氢氧化钠标准液滴定至pH为9.2，记下消耗氢氧化钠标准液的毫升数。

取80 mL水用氢氧化钠标准液滴定至pH为9.2，同时做空白试验。

1.2.2 总酸的测定(中和滴定法)

在100 mL容量瓶中放入5.0 mL样品，加水稀释至刻度后混合均匀，吸取20.0 mL，放入200.0 mL烧杯中，加入60.0 mL水，将玻璃电极和甘汞电极放入样品后启动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准滴定，直至酸度计指示pH为8.2。记录氢氧化钠标准滴定溶液(0.05 mol/L)毫升数的用量，便能够计算总酸含量。

量取80 mL水，用氢氧化钠标准滴定溶液(0.05 mol/L)将样品调整至pH为8.2。同时做试剂空白试验。

1.2.3 食盐含量的测定(硝酸银滴定法)

在200 mL锥形瓶中放入2.0 mL样品稀释液，加入1 mL铬酸钾溶液和100 mL水，混合均匀，用硝酸银标准溶液滴定至初显橘红色。

用量筒取100 mL水，并做空白试验。

1.2.4 挥发性盐基氮(TVB-N)的测定(半微量定氮法)

在均质杯中放入10 g样品，随后放入90 mL高氯酸，均质2 min后可使其离心分离。

在锥形瓶中放入10 mL硼酸吸收液，加入几滴混合指示剂，并将锥形瓶放在半微量定氮仪蒸馏冷凝管的下方，让它下端能够置于硼酸吸收液的液面下。

在半微量定氮仪反应室中注入精确量取的5 mL样品滤液，并同时加入1～2滴酚酞指示剂和5.0 mL氢氧化钠溶液，随后快速夹紧橡胶皮管，同时在入口处加少量防止漏气。

加热进入蒸汽以蒸馏，5 min后把冷凝管的下端转移出锥形瓶内吸收液的液面外，随后再蒸馏1 min，用适量水淋洗冷凝管下端，水接入锥形瓶中。

锥形瓶内的吸收液用盐酸标准溶液滴定至溶液呈蓝紫色为终点。同时用5.0 mL高氯酸取代样品中的滤液进行空白对照。

1.2.5 无盐固形物的测定(烘干法)

在100 mL容量瓶中放入10.00 mL样品试液，加水溶解至刻度后摇晃均匀。在已烘干至恒重的称量瓶中加入以上稀释液5.00 mL，转移至105 ℃电热恒温干燥箱内，把瓶盖斜放在瓶边。烘4 h后，盖上瓶盖，取出，转移至干燥箱中，降至室温后称重。继续烘0.5 h，冷却，称重，直到2次称重相差不超过1 mg，视为恒重。此时可得到可溶性总固形物的含量。

用样品中可溶性总固形物的含量减去样品中氯化钠的含量，即可得到可溶性无盐固形物的含量。

1.2.6 总氮含量(T-N)(凯氏定氮法)

1.2.6.1 消化

在干燥的消化瓶中放入2.0 mL样品，随后加入2 g硫酸铜和硫酸钾混合试剂、15 mL浓硫酸，置于通风橱中加热(消化瓶口放置小漏斗，将消化瓶45°斜放在电炉上)。当内含物悉数炭化、泡沫全部停止后，继续使消化瓶内溶液微沸。直至炭粒完全消失，消化液为澄清的浅绿色，继续加热15 min，取出，待降至室温，徐徐加水定容至100 mL备用。

1.2.6.2 蒸馏

把冷凝管末端的导管没入装有10 mL 2%硼酸溶液和1～2滴混合指示液的锥形瓶的液面内，吸取10 mL消化稀释液，随凯式烧瓶瓶壁慢慢加入凯氏定氮仪内，同时加入10 mL 40%氢氧化钠溶液，快速连接蒸馏装置(整个装配应严密不漏气)，开通冷凝水，摇晃凯氏烧瓶，将锥形瓶的位置放低，使冷凝管末端与液面分离，再蒸馏1 min，停止加热。用适量水淋洗冷凝管末端的外部，取出锥形瓶。

1.2.6.3 滴定

用0.1 mol/L盐酸标准滴定溶液滴定收集液至紫红色为终点，记录消耗0.1 mol/L盐酸标准滴定溶液的毫升数，同时做空白试验。

1.2.7 非酶褐变指数(Hendel法)

5 mL的样液用50 mL 50%的乙醇提取1 h，期间不断搅拌。提取液经过滤纸过滤。将分光光度计调整至420 nm，取适量滤液在此处测定吸收值。

1.2.8 pH值测定(pH酸度计)

取适量样品，将经过校正的pH计插入样品中，期间不断搅拌样品，待pH计读数稳定后便可记下数据。

2 试验结果及数据分析

上述实验均进行3次平行实验，取平均值，所得原始数据和变化图用Excel计算并制出。

2.1 氨基酸态氮

氨基酸态氮含量的变化见图1。

图1 氨基酸态氮含量的变化

由图1可知，氨基酸态氮的含量随着发酵天数的不断增加而增多，在发酵时间的前5天内，氨基酸态氮的含量增加速度最快，之后的发酵时间里增长速度趋于平缓，氨基酸态氮增长速度越平稳，表示发酵完成程度越高。由于在发酵初期，蛋白质分解作用明显，此时氨基酸态氮也快速增加，随着发酵的进行，鱼露中的蛋白质分解酶逐渐失去活性，故氨基酸态氮的增加就缓慢下来。

2.2 总酸含量

总酸的变化见图2。

图2 总酸的变化

由图2可知，在发酵的前5天时间里，总酸度下降趋势明显；在发酵的第5～25天时间里，总酸的含量不断上升，第25天至发酵结束，总酸的含量又略微有所下降。总酸含量的变化可能是由于发酵过程中微生物产酸量和产生的碱性挥发性盐基氮成分相互作用的结果。另外，发酵初期菌体利用糖类分泌酸，酱油曲加入以后，由于耐盐性乳酸菌Pediococcussp.的增殖而使醪中的 pH值随之下降，而醪中的总酸量也随着增加。

2.3 食盐含量

食盐含量的变化见图3。

图3 食盐含量的变化

由图3可知，样品在发酵时间为前15天时，食盐含量增长较快；发酵时间在第15～20天时，食盐含量增长速度减缓；发酵时间在第20～25天时，食盐含量有所下降；第25天至发酵结束，食盐含量又有所上升，总趋势是趋于平稳，最终食盐含量约为11.01 g/dL。发酵过程中的发酵温度造成鱼露水分的挥发和鱼露中盐类物质的生成，都会造成样品中食盐含量的增加。

2.4 挥发性盐基氮(TVB-N)

挥发性盐基氮含量的变化见图4。

图4 挥发性盐基氮含量的变化

由图4可知，在前5天的发酵时间内，挥发性盐基氮含量大幅度上升；发酵时间为第5～20天时，含量不断下降；第20天至发酵结束，挥发性盐基氮含量有所回升，但含量始终处在较低水平。加入酱油曲后，曲中的有益菌大量繁殖并处于优势地位，很大程度上抑制了腐败菌的繁殖，使得挥发性盐基氮含量不断下降，可见加入酱油曲对于鱼露产品的保藏和产品品质的提升具有良好效果。

2.5 无盐固形物

无盐固形物含量的变化见图5。

图5 无盐固形物含量的变化

由图5可知，样品中的无盐固形物含量在发酵的前5天呈现上升的趋势；发酵时间的第5～15天时，含量有所下降；发酵时间在第15～20天时，含量上升幅度较大；在发酵时间为第20～25天时出现了明显下降，下降幅度大于发酵20天时所上升的幅度；第25天至发酵结束又有所回升。无盐固形物中的主要成分是蛋白质、氨基酸、肽、糖类和有机酸等物质，样品中无盐固形物的不稳定变化是由于随着发酵时间的变化，样品中的蛋白质、氨基酸和糖类等物质含量的变化造成的。

2.6 总氮含量

可溶性总氮含量的变化见图6。

图6 可溶性总氮含量的变化

总氮含量可表现出鱼露产品品质的优劣，溶出的氮含量越高，表示鱼露产品的质量越好。由图6可知，在第1～10天的发酵时间内，可溶性总氮的含量逐渐增加，第10～20天的发酵时间内可溶性总氮有所下降，从第20天至发酵结束可溶性总氮的含量又开始上升。实验过程中可溶性总氮增加的原因主要是原料蛋白质不断被蛋白酶水解成可溶性的肽类及氨基酸成分；可溶性总氮下降的原因可能是某种成分的活性增强，抑制了蛋白酶的水解，而随着发酵时间的增加，其抑制能力减弱，可溶性总氮含量又恢复上升趋势。

2.7 非酶褐变指数

非酶褐变指数的变化见图7。

图7 非酶褐变指数的变化

由图7可知，发酵过程中非酶褐变程度随着发酵时间的延长不断升高，非酶褐变主要是由美拉德反应产生，随着非酶褐变指数的增加，鱼露的颜色由最初的淡褐色变为最后的深褐色。由于取样时要经过高温处理，因此其本身会产生褐变反应，鱼露中含有的糖类、蛋白质或氨基酸，在加热过程中迅速产生褐色素。Yaylaian 指出食物原料经高温高压处理时，会产生褐变反应，食物系统中含有还原糖及蛋白质或氨基酸，在加热过程中，迅速反应产生褐色素。

2.8 pH值

pH值的变化见图8。

图8 pH值的变化

由图8可知，在开始发酵的前5天时间内，pH呈现上升趋势；在第5～25天的发酵时间内，pH不断下降；从第25天到发酵结束，pH又有所上升。在开始发酵的前5天时间内，样品中的碱性挥发性盐基氮类物质生成量较多，造成pH的上升；在第5～25天的发酵时间内，来自鱼内脏和酱油曲中的产酸微生物活跃，产酸较多，使pH不断下降；发酵后期由于米曲霉将蛋白质分解成小分子的胺、氨等碱性物质的产量大于其产生的酸的产量，导致pH有所上升。

3 结语

本实验所制得鱼露产品经30天发酵后，最终的各项指标为氨基酸态氮含量1.25 g/dL；总酸含量1.70 g/dL；食盐含量11.01 g/dL；挥发性盐基氮含量182 mg/dL；可溶性总氮含量0.212 g/dL；无盐固形物含量10.8 g/dL；非酶褐变指数0.948；pH值5.09。根据鱼露行业标准SB/T 10324-1999，氨基酸态氮指标已超过一级标准，可溶性总氮和食盐含量与标准相比还比较低。实验过程中挥发性盐基氮含量在不断下降，符合鱼露的生产要求。

传统鱼露生产方法耗时长且原料多为鱼虾等，对利用淡水鱼下脚料经酱油曲速酿鱼露生产的研究，将资源最大程度地利用起来，变废为宝，节约资源，减轻环境污染，因鱼露具有独特风味，深受广大沿海居民的喜爱，因此具有广阔的市场前景和经济价值，值得不断进行深入研究和探讨。

参考文献：

[1]龚钢明,顾慧,蔡宝国.鱼类加工下脚料的资源化与利用途径[J].中国资源综合利用,2003(7):23-24.

[2]童军锋,张英.加强鱿鱼资源的加工和综合利用技术研究[J].东海海洋,2001,19(4):46-50.

[3]赖海涛,黄志勇,涂开生.酶法提取烤鳗下脚料水解动物蛋白的研究[J].集美大学学报(自然科学版),2002,7(1):11-14.

[4]黄椿鉴,傅红,汪少芸,等.鱼露外加酶工艺的探讨[J].福州大学学报(自然科学版),1997,8(4):25.

[5]陈有容,张雪花,齐凤兰,等.白鲢废弃物发酵鱼露的成份分析及评价[J].中国水产,2002(4):73.

[6]何雪莲,罗非鱼加工下脚料发酵生产鱼露的研究[D].海口：华南热带农业大学，2007.

[7]张雪花,陈有容,内田基晴,等.鲢及其加工废弃物发酵鱼露的比较[J].上海水产大学学报,2000,9(3):226-230.

[8]候温甫,黄泽元,汪秀文,等.淡水鱼加工下脚料速酿低盐鱼露的工艺研究[J].食品科学，2009,30(23):322.

[9]毋瑾超,朱碧英,胡锡钢,等.鱼肉液体制曲的工艺条件[J].湛江海洋大学学报,2002,22(3):33-37.

[10]陈仓林.鱼露的天然发酵工艺[J].传统酿造,2001,113(3):39-40.