山西老陈醋发酵阶段一株产酶芽孢杆菌的分离与鉴定

乔羽，于迪，范振宇，邢晓莹，王如福*

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 晋中 030801； 2.山西农业大学 园艺学院，山西 晋中 030801)

山西老陈醋是传统的固态发酵食醋，在其整个发酵过程中，微生物种类丰富，其生长代谢产生多种酶，对于山西老陈醋整个酿造过程至关重要。依据其催化机理分为淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等[1]。淀粉酶主要是利用原料中的淀粉生成葡萄糖；纤维素酶可将原辅料中的纤维素分解为微生物发酵可利用的糖，同时分解植物的细胞壁，使细胞中的淀粉、蛋白质等大分子物质流出，更容易被微生物利用[2-7]；蛋白酶可以分解原辅料中的蛋白质，供微生物生长繁殖利用，同时也在一定程度上形成一些风味物质。因此，淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶对山西老陈醋的最终产量和品质具有重要的影响。

芽孢杆菌能产生包括淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等在内的多种酶类。枯草芽孢杆菌产生淀粉酶、蛋白酶的能力已在工业生产中得到应用[8,9]。芽孢杆菌在大曲和整个发酵过程中始终存在，这可能是由于其极强的抗逆性[10,11]。因此产酶芽孢杆菌合理的应用对提高老陈醋品质具有重要意义。

本研究跟踪山西老陈醋的发酵过程，从不同发酵天数的酒醪和醋醅中分离能够产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶的芽孢杆菌；筛选出高产酶的优势菌株。后续可将其应用于山西老陈醋的发酵阶段，为提高老陈醋的还原糖含量、氨基酸态氮含量及最终产品品质提供宝贵的菌种资源基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验样品

样品：取自山西某醋厂；酒醪：山西某醋厂，发酵时间为1，4，7，10天；醋醅：发酵时间为1，3，5，7，9天。每个样品3份，置于4 ℃冰箱保存，备用。

1.1.2 试验试剂

碘、碘化钾、孔雀石绿、番红、无水葡萄糖、可溶性淀粉、干酪素、L-酪氨酸、羧甲基纤维素纳、刚果红、氯化钠、福林酚试剂、盐酸、碳酸钠、三氯乙酸。

1.1.3 培养基

营养琼脂培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化钠5 g、琼脂15 g，定容至1000 mL，121 ℃灭菌20 min，备用。

种子培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g 、氯化钠5 g，定容至1000 mL，121 ℃灭菌20 min，备用。

淀粉水解培养基：可溶性淀粉2 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、琼脂粉20 g、氯化钠 5 g，定容至1000 mL，121 ℃灭菌20 min，备用[12]。

酪素培养基：分别配制A液和B液，A液：Na2HPO4·7H2O 1.07 g，干酪素5 g，加适量蒸馏水，并加热溶解；B液：KH2PO40.36 g，加水溶解。A液和B液混合后加琼脂20 g，定容至1000 mL，121 ℃灭菌20 min，备用[13]。

羧甲基纤维素钠培养基：磷酸氢二钾0.5 g、(NH4)2SO42 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、微晶纤维素粉1.88 g、刚果红0.2 g、琼脂18 g，定容至1000 mL，121 ℃灭菌20 min[14]。

改良淀粉酶发酵培养基：高粱粉5.0 g、可溶性淀粉5 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖1 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl2·2H2O 0.2 g，定容至1000 mL，121 ℃灭菌20 min，备用[15]。

改良蛋白酶发酵培养基：黄豆粉20.0 g、高粱粉10.0 g、蛋白胨2.0 g、KH2PO41.5 g、K2HPO41.5 g、(NH4)2SO41.5 g、CaCl20.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 2.0 g、葡萄糖5.0 g、蒸馏水1000 mL，121 ℃灭菌20 min，备用[16]。

改良纤维素酶发酵培养基：高粱粉5.0 g、CMC-Na 10 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨 5 g、酵母粉5 g，定容至1000 mL，121 ℃灭菌20 min，备用[17]。

1.2 仪器与设备

SPX-100B-Z生化培养箱 北京瑞科中仪科技有限公司；BPX-272电热恒温培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Neofuge 23R台式高速冷冻离心机 上海力申科学仪器有限公司；2100型分光光度计 大尼科(上海)仪器有限公司；LEICA DM750生物显微镜 德国徕卡显微系统有限公司；ZQPL-200立式全温振荡培养箱 天津莱玻特瑞设备有限公司；Centrifuge 5424R低速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；DYY-6C型电泳仪 北京市六一仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 产酶芽孢杆菌的初筛

称取10 g不同发酵天数的酒醪、醋醅样品置于装有90 mL无菌水的三角瓶中，80 ℃水浴加热10 min富集芽孢杆菌，对富集液进行10倍梯度稀释；吸取100 μL不同稀释倍数的菌悬液分别涂布至淀粉水解培养基、酪素培养基和羧甲基纤维素钠培养基上，每个梯度做3个平行；37 ℃恒温培养48 h。淀粉水解培养基中加入一定量的卢氏碘液染色，即可看到水解圈的情况，酪素培养基和羧甲基纤维素钠培养基可直接观察透明圈的大小。

选取初筛培养基中有明显水解圈的单个菌落，编号。采用分区划线法连续纯化3代后，固体斜面4 ℃保存备用。将已纯化的芽孢杆菌分别再次接于淀粉水解培养基、酪素培养基和羧甲基纤维素钠培养基上，37 ℃培养48 h后，用游标卡尺分别测量水解圈直径(D)和菌落直径(d)，计算两者比值(D/d)大小，初步确定产酶活力的高低并挑选出比值较大的菌株。

1.3.2 产酶芽孢杆菌的复筛

将初筛得到的菌株挑取1环接种于种子培养基中，30 ℃摇床培养24 h。按照 2%的接种量分别接种于50 mL发酵培养基中，37 ℃ 180 r/min摇床培养48 h后，8000 r/min离心10 min，收集上清液为待测粗酶液。

淀粉酶活力测定:采用DNS测其淀粉酶活力[18]。酶活力单位定义：在40 ℃、pH值为3.7的条件下，1 mL酶液每1 min水解可溶性淀粉产生1 μg葡萄糖为1个酶活力单位(U/mL)。

酸性蛋白酶活力测定:按照国家标准SB/T 10317-1999 对各菌株发酵液中蛋白酶活力进行测定[19]。酸性蛋白酶酶活力单位定义为1 mL酶液在40 ℃、pH值为3.0的条件下，每1 min酪蛋白产生1 μg酪氨酸为1个酶活力单位(U/mL)。

纤维素酶活力测定:按照文献[20]中方法对各菌株发酵液中纤维素酶活力进行测定。纤维素酶活力单位定义为1 mL酶液在38 ℃ 1 min水解羧甲基纤维素产生1 μg葡萄糖为1个酶活力单位(U/mL)。

1.4 高产酶菌株的鉴定

形态学鉴定：对菌株的菌落形态和细胞形态进行观察。

生理生化鉴定：参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第8版中芽孢杆菌属特征和东秀珠的《常见细菌系统鉴定手册》进行部分生理生化特性鉴定[21,22]。

分子生物学鉴定：采用16S rDNA鉴定。利用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒对菌株的基因组DNA进行提取，采用细菌16S rDNA通用引物，以菌株的DNA基因组为模板。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.2 min，30次循环；72 ℃延伸7 min。取4 μL的PCR产物于2%琼脂糖凝胶中进行电泳。将扩增成功的PCR 产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，得到的序列在GenBank数据库中进行Blast比对，下载同源性高的序列，利用Mega 6.0软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 产酶的芽孢杆菌的筛选

从醋厂采集的不同发酵天数的酒醪和醋醅9份样品中，分离纯化得到60株产淀粉酶的芽孢杆菌，50株产蛋白酶的芽孢杆菌，48株产纤维素酶的芽孢杆菌。所筛选菌株产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶菌株的部分透明圈平板情况见图1。

图1 所筛选菌株产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶菌株的部分透明圈平板Fig.1 Part of transparent circle plates of strains for producing amylase, acid protease and cellulase

通过计算透明圈和菌落生长直径的比值，挑选出6株D/d比值大于8的产淀粉酶的芽孢杆菌，6株D/d比值大于5的产蛋白酶的芽孢杆菌，6株D/d比值大于5的产纤维素酶的芽孢杆菌，见表1。

表1 产酶菌株的初步筛选Table 1 Preliminary screening of enzyme-producing strains

由表1可知，菌株JT10-9，CD92-3，JX4-13的水解圈直径和菌落直径比值较大，说明其产酶的能力相对较高。

2.2 产酶菌株的复筛结果

测定初筛得到的18株芽孢杆菌的发酵液中淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶酶活力，并对每株菌产酶情况进行综合评分(淀粉酶酶活力占50%，蛋白酶酶活力和纤维素酶酶活力各占25%)，结果见表2。

表2 初筛菌株淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶酶活力Table 2 The activities of amylase, protease and cellulase of preliminary screened strains

由表2可知，综合淀粉酶活力、酸性蛋白酶活力和纤维素酶活力，菌株JX4-13的综合评分最高，因此筛选菌株JX4-13作为目的菌株并对其进行鉴定。

2.3 菌株个体及菌落形态观察结果

综合菌株的初筛和复筛结果，选取综合评分最高的菌株JX4-13作为目标菌株。对菌株JX4-13进行了个体形态和菌落形态的观察，见图2。

图2 菌株 JX4-13 的菌落特征及细胞形态Fig.2 Colony characteristics and cell morphology of strain JX4-13

由图2可知，菌株JX4-13的菌体形态为杆状，革兰氏染色阳性，芽孢端生，孢囊不膨大。菌落呈乳白色，菌落直径为2.10～2.90 mm，圆形或近圆形，表面干燥，不透明。

2.4 生理生化特征鉴定结果

表3 菌株JX4-13生理生化鉴定结果Table 3 Physiological and biochemical identification results of strain JX4-13

注：表中“+”表示该项目指标为阳性或生长；“-”表示该项目指标为阴性或不生长。

由表3可知，菌株JX4-13的生理生化特征与《常见细菌系统鉴定手册》中芽孢杆菌属特征相符，进一步确定菌株JX4-13属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

2.5 16S rDNA鉴定结果

菌株JX4-13 16S rDNA电泳结果见图3。

图3 菌株JX4-13 16S rDNA电泳结果Fig.3 PCR results of JX4-13 16S rDNA gene

以细菌基因组为模板，经过PCR扩增后，由图3可知，菌株的PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测出大约在1400 bp处存在一条特异性条带。测序获得PCR产物为1395 bp长度的序列。将序列输入到GenBank 数据库中通过Blast比对进行同源性比较，并从GenBank选取芽孢杆菌属的不同菌株，利用Mega 6.0软件构建系统发育树，见图4。

图4 菌株JX4-13的系统发育进化树Fig.4 Phylogenetic tree of JX4-13

由图4可知，菌株JX4-13在系统发育上与Bacillussubtilis同属于一个分支，置信度为99%。通过Blast比对，与Bacillussubtilis16S rDNA的同源性高达99%以上。因此，结合菌株JX4-13的菌落形态、细胞形态、生理生化鉴定结果，确定菌株JX4-13为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

3 结论

本试验对山西老陈醋发酵阶段产淀粉酶、酸性蛋白酶和纤维素酶的菌株进行了分离筛选；通过涂布淀粉、酪素和羧甲基纤维素钠初筛平板及酶活力测定，获得1株能够产淀粉酶、酸性蛋白酶和纤维素酶且酶活力较高的菌株JX4-13。对菌株JX4-13的菌落形态、细胞形态、生理生化鉴定结果以及 16S rDNA鉴定结果，最后得出菌株JX4-13为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

菌株JX4-13分离自老陈醋发酵过程中，可适应山西老陈醋发酵环境，比加入酶制剂，从酒醪、醋醅中分离出的土著菌株更容易融入整个发酵过程。后续可继续研究利用该菌株强化大曲或者混菌发酵应用到发酵过程中，这将为提高对原辅料中淀粉、蛋白质和纤维素的分解利用，改善老陈醋风味，提升老陈醋产品品质奠定理论基础。

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