不同产地小茴香香气成分差异分析

魏泉增，胡旭阳

(1.许昌学院 食品与生物工程学院,河南 许昌 461000；2.河南省食品安全生物标识快检技术重点实验室,河南 许昌 461000)

小茴香，既是调味料，又是具有较高价值的中药[1]。小茴香主要香气成分具有抗癌和抗菌活性[2,3]，因此小茴香的香气成分报道较多。香气成分常见提取方法有3种：水蒸气蒸馏(WD)法，具有设备比较简单、操作容易等优点，得到的主要香气成分为柠檬烯、反式茴香脑、α-水芹烯及爱草脑等[4-6]。同时蒸馏萃取(SD)法，具有微量成分提取效率高，适用于热稳定、沸点高的物质，得到主要香气成分为反式-茴香脑、爱草脑、葑酮及茴香醛[7]。固相微萃取(SPME)法，具有无萃取溶剂、操作时间相对较短、使用的样品量小的优点，得到主要香气成分是反式-茴香脑、顺式-茴香脑、爱草脑、葑酮和p-茴香醛等[8]。目前，一个产地小茴香气成分报道较多，不同产地小茴香香气成分差异鲜有报道，本文采用不同提取方法结合GC-MS，比较了不同产地小茴香香气成分的差异。采用主成分分析和聚类分析SPME法得到不同产地香气组成的相似度，这为不同品种的小茴香资源的综合利用开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

原料：5种小茴香的原料均购买于当地超市，分别为四川某某小茴香(以下简称为四川小茴香)、甘肃某某小茴香(以下简称为甘肃小茴香)、青海某某小茴香(以下简称青海小茴香)、山东某某小茴香(简称为山东小茴香)，北京某某小茴香(以下简称为北京小茴香)。以甘肃、北京、四川、青海、山东的小茴香为原料(打碎30 s，过筛40目)。

1.2 试剂与仪器

试剂：二氯甲烷(色谱纯)、蒸馏水。

仪器：7890B-7000C型气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；萃取手柄和萃取头65 μm PDMS/DVB(聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯) 青岛贞正分析仪器有限公司；恒温水浴锅 常州智博瑞仪器有限公司；粉碎机 上海圣科仪器设备有限公司；电子天平、电炉 上海菁海仪器有限公司；水蒸气蒸馏装置 郑州兴华玻璃仪器公司；同时蒸馏萃取装置 赛克斯玻璃仪器有限公司。

1.3 香气萃取

1.3.1 水蒸气蒸馏

粉碎的小茴香准确称取10.00 g，置于200 mL平底烧瓶中，加入100 mL蒸馏水，沸腾2 h。抽取2 mL挥发油备用，不同产地分别重复3次。

1.3.2 同时蒸馏萃取

粉碎的小茴香准确称取10.00 g，置于500 mL圆底烧瓶中，加入200 mL去离子水。将40 mL二氯甲烷倒入100 mL圆底烧瓶中。500 mL圆底烧瓶用电炉加热，100 mL圆底烧瓶用恒温水浴加热，温度控制在60 ℃。两侧同时回流时开始计时，提取2 h，抽取2 mL二氯甲烷备用，不同产地分别重复3次。

1.3.3 顶空固相微萃取

粉碎的小茴香称取1.00 g置于15 mL顶空瓶中，加入5 mL去离子水，60 ℃平衡30 min，60 ℃顶空吸附30 min，气相气化室250 ℃解吸附3 min，不同产地分别重复3次。

1.4 GC-MS分析条件

水蒸气蒸馏方法的气相色谱条件：DB-WAX柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气He(99.999%)；恒流，柱流速1.2 mL/min；分流比100∶1，进样量1.0 μL，进样口温度250 ℃；压力：19.93 kPa；升温程序：50 ℃先以4 ℃/min升至110 ℃，然后以5 ℃/min升至160 ℃，再以3 ℃/min升至190 ℃，保持20 min。每个产地的小茴香平行3次，每种化合物峰面积取3次的平均值。

同时蒸馏萃取方法的气相色谱条件：DB-WAX柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气He(99.999%)；恒流，柱流速1.2 mL/min；分流比2∶1，进样量1.0 μL，进样口温度250 ℃；压力：19.93 kPa；升温程序：50 ℃先以3 ℃/min升至110 ℃，然后以5 ℃/min升至150 ℃，再以3 ℃/min升至180 ℃,保持10 min。每个产地的小茴香平行3次，每种化合物峰面积取3次的平均值。

固相微萃取方法的气相色谱条件：DB-WAX柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气He(99.999%)；恒流，柱流速1.2 mL/min；分流比100∶1，进样量1.0 μL，进样口温度250 ℃；压力：19.93 kPa；升温程序：50 ℃先以4 ℃/min升至90 ℃，然后以5 ℃/min升至140 ℃，再以4 ℃/min升至180 ℃，保持10 min。每个产地的小茴香平行3次，每种化合物峰面积取3次的平均值。

质谱条件：EI源，电子能量70 eV，离子源230 ℃，四极杆温度150 ℃，扫描模式MS1，扫描范围29～700 amu。

1.5 香气物质的定性与半定量

香气物质采用NIST 14 质谱数据库检索进行定性，取相似度大于70%的化合物；用峰面积表示化合物含量。

1.6 数据分析

试验数据采用PAST软件，采用模型correlation对不同产地小茴香进行主成分分析，采用配对分组算法(paired group)，相似度采用Rho法进行不同产地小茴香聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取小茴香香气成分

2.1.1 SD提取小茴香香气成分的分析

SD提取小茴香的挥发性香气成分GC-MS分析，结果见图1。共鉴定出38种香气成分，包括18种烃类物质、5种醇类、5种醚类、3种醛类和7种酮类物质。

图1 采用SD法不同产地小茴香香气成分Fig.1 Aroma compounds of fennel from different places of origin with SD method

由图1可知，采用SD法，香气成分中醚类物质的含量最多,但北京、甘肃、青岛、山东4个产地的小茴香香气中醚类物质含量相似，四川小茴香香气中，醚类含量偏低。5个产地小茴香香气中，烃类物质含量次多，四川小茴香中烃类物质偏低，其他产地烃类物质含量相似。5个产地小茴香醛类中，山东含量最高，四川含量最低，其他3个产地含量相似。5个产地中四川酮含量偏低，其他4个产地酮含量相似。而5个产地小茴香、醇类、酚类、酯类含量较少。

2.1.2 SPME提取小茴香香气成分的分析

采用SPME提取小茴香的挥发性香气物质，结果见表1。不同产地的小茴香中共鉴定出19种香气成分，其中包括3种烃类物质、7种萜烯，1种醇类、1种酯类、2种醚类、2种醛类、2种酮类和1种酸类物质。采用SPME法，见图2。5个产地小茴香香气成分中醚类物质含量最多，不同产地醚类含量相似。烃类物质四川含量偏低，其他4个产地含量相似。醛类物质含量，甘肃含量最低，山东含量最高，其他3个产地含量相似。5个产地小茴香酮类含量相似。5种产地小茴香、酯类、酸类、醇类含量较少。

图2 采用SPME法不同产地小茴香香气成分Fig.2 Aroma compounds of fennel from different places of origin with SPME method

编号名称中文名称北京甘肃青海山东四川1Xanthoxylin花椒素酯类NDND14725260±2653215.41NDND2D-Carvone香芹酮酮类2029152.33±169642.753093422±1036892.852023643.67±107181.331892555.67±162335.2510772785±130782.733Fenchone葑酮酮类13173987±1009928.6714691848±2226025.8621731403.67±972525.420928459±4084967.3913555742.67±1756585.84α-Phellandreneα-水芹烯萜烯NDND1720673.67±181396.53NDND5γ-Terpineneγ-松油烯萜烯16643573±1058333.4516380118±6457782.3319586802±4220661.8428389758±993455.7611464940±837551.886Benzene,1-methyl-3-(1-methylethyl)-1-甲基-(2-甲基乙基)-苯烃类12623540.33±547940.17526635.67±2052908.8513289688.67±2739676.2520397755±1567311.2820111593.33±1610113.867Bicyclo[3.1.0]hexane,4-methylene-1-(1-methylethyl)-双环[3.1.0]己烷,4-亚甲基-1-(1-甲基乙基)-烃类ND3282601±119064.64ND4353095.33±216311.34ND

续 表

注：ND表示未检出。

2.1.3 WD提取小茴香香气成分分析

采用WD法提取小茴香的挥发性香气物质，数据未给出。结果表明：5种产地小茴香香气成分中共鉴定出107种香气成分，其中包括35种烃类物质、23种醇类、14种醚类、1种酸类、1种酚类、10种酯类、10种酮类和13种其他物质。采用WD法，见图3。5个产地小茴香香气成分中醚类物质含量最多，四川小茴香醚类含量最多，北京小茴香醚类含量最少，其他3个产地小茴香醚类含量差异较大。烃类物质甘肃含量最多，北京含量最少，其他3个产地小茴香烃类含量差异较大。酮类、醛类、酸类、酯类、醇类和酚类含量较少。

图3 采用WD法不同产地小茴香香气成分Fig.3 Aroma compounds of fennel from different places of origin with WD method

SD法、SPME法、WD法3种提取方法分析不同产地的小茴香香气成分，结果表明醚类物质种类少，但醚类的含量大。醇类、酯类、酮类和醛类含量少，烃类物质种类最多，烃类物质的含量也少，酸类和酚类含量最少。SD法、SPME法和WD法提取不同产地小茴香香气种类含量大体相似，醚类含量最多，但不同提取方法对提取不同产地小茴香不同香气种类含量有较明显差异。

2.2 不同产地小茴香香气成分比较

2.2.1 醇类香气物质比较

5种小茴香中共检测到26 种醇类物质，北京、甘肃、青海、山东、四川分别检出2，11，3，20，15种，SD法检测到5种醇类,SPME法检测到1种醇类,WD法检测到24种醇类。结果表明：采用WD法,醇类在5 种小茴香种差异明显。桉叶油醇是小茴香中含量最高的醇。松油醇具有油味、樟脑气味和甜味。甘肃、青海、四川产地的小茴香WD法检测到松油醇，其他产地未检测到。

2.2.2 酯类香气物质比较

5个产地小茴香中共检测到10种酯类物质，其中，WD法检测出10种酯类物质，SPME法检出1种，SD法未检出酯类。WD法检出5个产地小茴香酯类物质种类差异明显，四川检出8种，9,12-十八碳二烯酸甲酯是含量最高的酯类。甘肃小茴香检出丁酸-3-甲基-异戊酯和乙酸松油酯。采用SPME法在青海小茴香只检出1种酯类，花椒素。

2.2.3 醛类香气物质比较

5个产地小茴香共检测出4种醛类物质,其中,SD法检测出2种,SPME法检测出2种,WD法检测出4种。结果表明：具有类似山楂味的3-甲氧基苯甲醛采用这3种方法在5个产地的小茴香中都检测到。采用WD法，3-甲氧基苯甲醛在山东小茴香中含量>在四川小茴香中含量>在甘肃和青海小茴香中含量>在北京小茴香中含量。采用SD法，3-甲氧基苯甲醛在山东小茴香中含量>在北京小茴香中含量>在青海和四川小茴香中含量>在甘肃小茴香中含量。采用SPME法，3-甲氧基苯甲醛在山东小茴香中含量>在四川小茴香中含量>在青海和北京小茴香中含量>在甘肃小茴香中含量。由此，采用不同提取不同产地的小茴香同一香气成分含量的变化并不相同，这表明不同香气提取方法对不同产地小茴香香气成分的收率也不同。2-乙缩醛-6-甲基-3,5-庚二烯醛和2-甲基-3-苯基-丙醛只在四川小茴香中检测到。

2.2.4 酮类香气物质比较

5种小茴香中共检出13种酮类物质，其中SD法检出6种,SPME法检出2种,WD法检出10种。葑酮(fenchone)是抗菌素的一种，能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。呈浓郁甜的果香、青香和木香，具有鲜花和水果甜香气。采用WD法提取葑酮，山东小茴香中含量>甘肃小茴香中含量>四川和青海小茴香中含量>北京小茴香中含量。香芹酮有清凉而特有的芳香甜味，WD法提取香芹酮，四川小茴香中含量>甘肃、山东、青海小茴香中含量，北京小茴香中没有检测到，但采用SPME法和SD法在北京小茴香中检测到了香芹酮。采用SD法检出了1-(3-甲氧基苯基)-1-丙酮、薄荷酮、莰酮，其他2种方法未检出。

2.2.5 萜烯类香气物质比较

5种小茴香中共检出25种萜烯类香气物质，其中SD法检出12种物质，SPME法检出8种物质，WD法检出23种物质。柠檬烯是一种天然的功能单萜，有类似柠檬的香味。柠檬烯具有良好的镇咳、祛痰、抑菌作用。采用WD法，甘肃小茴香中柠檬烯含量>山东小茴香中含量>四川小茴香中含量>北京小茴香中的含量>甘肃小茴香中含量。采用这3种方法均检测到了α-水芹烯、β-月桂烯、β-水芹烯、γ-松油烯、3-蒈烯、柠檬烯这6种萜烯。氧化柠檬烯只有WD法检测到，其他2种方法未检测到。SPME法检测到了α-蒎烯。α-蒎烯具有植物和松节油香气[9]，感官阈值很低，香气明显。

2.2.6 醚类香气物质比较

5种小茴香中检出11种醚类。其中SD法检测出5种，SPME法检出2种，WD法检出10种。茴香脑是小茴香中主要的香气成分，可用于治疗癌症及长期接触放射线或药物所致或原因不明的低白细胞症[10]。草蒿脑呈大茴香似香气。采用SD法，山东小茴香中茴香脑含量>青海小茴香中含量>北京小茴香中含量>甘肃和四川小茴香中含量，采用SPME法，山东、北京、青海、四川小茴香中茴香脑含量相似，甘肃小茴香中茴香脑含量明显偏低。采用WD法，山东小茴香中茴香脑含量>四川小茴香中含量>甘肃小茴香中含量>青海小茴香中含量>北京小茴香中含量。采用SD法、SPME法和WD法提取不同产地的小茴香中香气成分，其中草蒿脑在不同产地小茴香中香气也出现了与茴香脑相似的情况，不同的前处理方法，导致草蒿脑在不同产地小茴香香气中含量发生了变化。采用WD法，检测到了对-丙烯基-1-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯、细辛脑、肉豆蔻醚、丁香酚甲醚、4-乙酰-1-甲基环己烷、(R)-氧化柠檬烯，而采用SD法和WD法在这5种小茴香中没有检测到。

2.2.7 烃类物质

除以上相对含量较高的香气物质外，还有少量的烷烃类物质，共检出15种物质。其中SD法检出7种物质，SPME法检出3种物质，WD法检出12种烷烃，这类物质大部分不参与呈香。

2.3 主成分分析

主成分分析(PCA)是一种降维或者把多个指标转化为少数几个综合指标的一种多元数理统计方法[11-13]。将5个产地小茴香样品的二维数据导入到PAST软件将数据标准化后进行主成分分析，5个不同产地小茴香采用SPME提取方法重复3次实验。不同产地小茴香香气成分PCA的分值图见图4，第一主成分的贡献率为41.9%，第二主成分的贡献率为23.7%。

图4 PCA分值图Fig.4 Score plot for PCA

由图4可知，青海、山东、甘肃、北京、四川5个产地具有明显差异，这为区分不同产地的小茴香提供了潜在的线索。

图5 载荷图(图中的数字对应表1中)Fig.5 Loading plot(the figure in the plot corresponds to that of table 1)

由图5可知，被分析化合物对主成分的影响，如果化合物远离原点表明这个化合物对主成分有强烈的影响，那么这些化合物可能就是区分不同产地小茴香的关键化合物，以γ-松油烯(5号，表1中)和柠檬烯(11号，表1中)为潜在特征物，为区分不同产地小茴香提供可能。

2.4 聚类分析

聚类分析是将样品按照品质特性的相似程度逐渐聚合在一起，相似度最大的优先聚合在一起，最终按照类别的综合性质多个品种聚合，从而完成聚类分析的过程[14]。对不同产地小茴香进行两两比对，相似性系数为0.8～1。结果表明：不同产地小茴香香气成分明显不同。

图6 不同产地小茴香的聚类分析图Fig.6 Clustering analysis diagram for the fennel from different places of origin

由图6可知，四川小茴香与其他四个产地小茴香香气成分的相似性最差，山东和北京的小茴香香气成分最相似，由聚类分析结果表明，产地相近的小茴香香气成分相似性大，而产地远的小茴香香气成分相似性小。

3 结论

WD法、SD法、SPME法3种提取方法对5个不同产地的小茴香香气成分提取，而后进行GC-MS分析，共鉴定出104种化学组分，包括15种烃类、24种醇类、10种酯类、4种醛类、1种酚类、2种酸类、11种醚类、13种酮类、萜烯24种。其中鉴定WD法93种、SD法39种、SPME法19种。3种提取方法都表明5个产地小茴香主要成分是茴香脑和草蒿脑。WD法测得的香气物质种类最多，SPME法测得的香气物质种类最少。不同的提取方法提取不同产地小茴香香气成分含量影响较大。SPME-GC-MS结合PCA分析结果表明：γ-松油烯和柠檬烯可为潜在特征物标记物，区分不同产地小茴香。聚类分析结果表明：产地相近的小茴香香气成分也相似。

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