D-氨基半乳糖酶法糖基化修饰玉米醇溶蛋白的条件优化及产物部分功能性质研究

王晓杰，刘晓兰，丛万锁，郑喜群，林巍

(齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院，黑龙江省普通高校农产品加工重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

玉米蛋白粉中约含62%～71%的蛋白质，其主要组分是玉米醇溶蛋白(65%～68%)和谷蛋白(22%～33%)[1]。玉米醇溶蛋白是高憎水性蛋白，而玉米谷蛋白易溶于稀碱性溶液[2,3]，两者水溶性差的特点严重限制了其在食品工业中的应用。因此，为了拓宽玉米蛋白在食品工业中的应用，需要对其进行改性处理。

在食品工业中，蛋白质的改性主要是采用美拉德反应。美拉德反应能够显著改善蛋白质的加工性质，如溶解性、乳化性、凝胶性等，以及抗氧化活性等生理功能特性[4-8]。然而，美拉德反应存在反应时间长，难以控制糖基化度，还会产生致突变物而存在安全隐患等缺点，所以随着人们食品安全意识的逐渐增强，需要研究一种比美拉德反应更安全的方法来进行食品蛋白质的改性。

转谷氨酰胺酶(transglutaminase, TGase, EC 2.3.2.13)能催化蛋白质分子中谷氨酰胺残基的γ-甲酰胺(氨基供体)和不同化合物的ε-氨基(氨基受体)之间异肽键的形成，属于酰基转移酶的范畴[9]。当受体由含有伯胺基团的糖提供时，如氨基葡萄糖等，则发生氨基糖与蛋白质的共价结合反应，即发生了蛋白质的酶法糖基化修饰。已有研究表明，TGase催化的酶法糖基化反应能够改善蛋白质的溶解性、流变学性质、凝胶性和抗氧化等功能性质[10-12]，并且其反应时间短，反应条件比美拉德糖基化更温和，不存在美拉德反应中所存在的副反应。

玉米蛋白含有高比例的谷氨酰胺残基，且赖氨酸残基含量少，因此，在含有伯胺基团的糖的反应体系中，TGase催化的糖基化反应主要发生在玉米蛋白与供糖体之间，而发生在玉米蛋白之间的交联反应几率低，因此玉米蛋白是酶法糖基化修饰的良好底物。目前为止，未见D-氨基半乳糖酶法糖基化修饰玉米醇溶蛋白的相关文献报道。本实验利用TGase催化D-氨基半乳糖与玉米醇溶蛋白分子之间发生共价结合，优化了糖基化反应条件，对修饰产物的部分功能性质进行了研究，以表征糖基化修饰对玉米醇溶蛋白功能性质的影响，为糖基化修饰玉米醇溶蛋白在食品工业中的应用奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

玉米蛋白粉：由中粮生化能源(龙江县)有限公司提供。

1.2 试剂

微生物TGase：购自泰兴市一鸣生物制品有限公司，酶活力1000 U/g；D-氨基半乳糖：购自上海御略化工有限公司；8-苯氨基-1-萘磺酸铵盐(ANS)：购自Sigma公司；SDS-PAGE电泳标准蛋白、辣根过氧化物酶、邻苯二甲醛：购自上海生工生物工程有限公司；其他试剂：均为国产分析纯。

1.3 主要仪器

SHZ-A型恒温水浴振荡器 上海跃进医疗器械厂；PC/PLCLD-53型真空冷冻干燥机 美国Millrock公司；超低温冰箱 美国热电公司；TDL-5-A型离心机、DL-1型集热式磁力加热搅拌器 上海安亭科学仪器厂；pB-10型pH计 北京赛多利斯仪器有限公司；全自动旋转蒸发器 瑞士Buchi公司；RF-530型荧光分光光度计 日本岛津公司。

1.4 实验方法

1.4.1 玉米醇溶蛋白的提取

参照文献[13]。

1.4.2 TGase催化玉米醇溶蛋白的糖基化反应

将玉米醇溶蛋白按照一定底物浓度配制成悬浮液，然后加入D-氨基半乳糖混合均匀，加热到一定温度并用2 mol/L NaOH调整至合适的pH值，加入TGase开始糖基化反应。对以下反应参数进行优化：反应初始pH 7.0，7.3，7.5，7.7，8.0，反应温度31，34，37，40，43 ℃，底物浓度1%，2%，3%，4%，5%，TGase添加量20，40，60，80，100 U/g蛋白，酰基供体与酰基受体的摩尔比1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5和反应时间8，9，10，11，12 h。反应结束后将样品于85 ℃水浴中灭酶5 min，冷却至室温。用截断分子量1000 Da的透析袋于4 ℃条件下透析48 h，除去未反应的D-氨基半乳糖，样品经冷冻干燥后备用。在相同反应体系中，以不加D-氨基半乳糖制备交联玉米醇溶蛋白。

1.4.3 糖基化修饰样品中D-氨基半乳糖含量的测定

采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定糖基化修饰产物中D-氨基半乳糖的导入量(mg/g蛋白)。取0.01 g糖基化修饰后的玉米醇溶蛋白样品于安瓿管中，加入2.5 mL 6 mol/L HCl，通过氮吹5 s排除管内的空气以防止氧化，用酒精喷灯灼烧安瓿管管口使其密封，放入100 ℃烘箱中酸水解8.0 h。取出样品，冷却后用滤纸过滤到10 mL的离心管中，吸取1 mL样液，加入2 mL 3 mol/L NaOH调节pH值，使pH值大于7.3，再从调节好pH值的样液中取1.0 mL，加入1.0 mL DNS试剂，沸水浴加热5 min，冷却后加入2 mL蒸馏水，混匀，测定500 nm处的吸光度值。带入半乳糖标准曲线，计算出修饰样品中的D-氨基半乳糖的接入量。

1.4.4 SDS-PAGE法确认玉米醇溶蛋白与壳寡糖发生糖基化反应

具体方法参照文献[14]。

1.4.5 玉米醇溶蛋白及其糖基化修饰产物部分功能性质的测定

1.4.5.1 溶解性

准确称量0.02 g糖基化修饰样品(以蛋白基计)以及对照样品(玉米醇溶蛋白和交联玉米醇溶蛋白)，分别加入10 mL pH 2～12的缓冲溶液，漩涡混匀30 s后放置在4 ℃冰箱中过夜，使样品充分水合。4 ℃条件下10000 r/min离心10 min，收集上清液后测定在280 nm处的吸光度值。

1.4.5.2 表面疏水性

参照Kato和Nakai的方法[15]，略有改动。称取玉米醇溶蛋白和糖基化修饰产物样品各0.3 g，分别加入30 mL 0.01 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.0)，放在室温下进行溶解。24 h后蛋白质样品在10000 r/min的条件下离心10 min，用Folin-酚法测定上清液中的蛋白质含量，然后用0.01 mol/L的PBS缓冲溶液(pH 7.0)稀释该上清液得到系列浓度(0.01～0.2 mg/mL)的蛋白质溶液。取蛋白质溶液4 mL，加入20 μL ANS(8 mmol/L，用pH 7.0，0.01 mol/L的PBS配制)，漩涡混匀，在室温条件下避光反应15 min。在激发波长390 nm、发射波长470 nm以及狭缝5 nm的条件下，测定ANS结合物的相对应荧光强度，以相对荧光强度对蛋白质浓度作图，以线性关系良好的回归曲线的斜率表示表面疏水性。

2 结果与讨论

2.1 D-氨基半乳糖糖基化修饰玉米醇溶蛋白的条件优化

2.1.1 反应初始pH值对玉米醇溶蛋白糖基化反应的影响

在反应温度37 ℃、玉米醇溶蛋白的底物浓度3%、酰基供体与受体摩尔比1∶3、TGase添加量60 U/g蛋白、反应时间8 h的条件下，研究反应体系初始pH对玉米醇溶蛋白分子中D-氨基半乳糖导入量的影响，实验结果见图1。

图1 反应初始pH值对玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影响Fig.1 Effect of initial pH value on amount of D-galactosamine conjugated onto zein

由图1可知，随着pH值的增大，玉米醇溶蛋白分子中D-氨基半乳糖的接入量呈先升高后降低的变化趋势，在pH值为7.5时，D-氨基半乳糖的接入量达到最大值，为7.04 mg氨基半乳糖/g蛋白；而当pH值大于7.5时，接糖量开始降低。pH值是影响D-氨基半乳糖稳定性及TGase催化活力的一个重要因素。在弱酸条件下，由于D-氨基半乳糖分子中的氨基被质子化多以-NH3+形式存在，影响了糖基的导入。在弱碱性条件下，虽然玉米醇溶蛋白的溶解性增强，但由于TGase催化活力降低和D-氨基半乳糖的结构不稳定而导致玉米醇溶蛋白分子中糖基的导入量降低[16]。因此，选取糖基化反应的最适初始pH值为7.5。

2.1.2 反应温度对玉米醇溶蛋白糖基化反应的影响

在反应初始pH 7.5、底物浓度3%、酰基供体与酰基受体摩尔比1∶3、TGase添加量60 U/g蛋白、反应时间8 h的条件下，研究不同反应温度对玉米醇溶蛋白分子中D-氨基半乳糖接入量的影响，实验结果见图2。

图2 反应温度对玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影响Fig.2 Effect of reaction temperature on amount of D-galactosamine conjugated onto zein

由图2可知，随着反应温度的升高，接糖量呈先升高后降低的变化趋势，在37 ℃时，接糖量最大，达9.77 mg/g蛋白。当糖基化温度超过40 ℃时，接糖量逐渐降低。温度对酶法糖基化反应的影响主要是影响反应速率常数和酶的催化作用，在较低的温度范围内，反应速率常数随温度的增加而增加，从而酶的催化反应速率增加，但超过一定温度后，TGase因发生热变性而影响其催化作用。因此，选择最适的反应温度为37 ℃。

2.1.3 底物浓度对玉米醇溶蛋白糖基化反应的影响

在反应初始pH 7.5、反应温度37 ℃、酰基供体与酰基受体摩尔比1∶3、TGase添加量60 U/g蛋白、反应时间8 h的条件下，研究不同底物浓度对玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影响，实验结果见图3。

图3 底物浓度对玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影响Fig.3 Effect of zein concentration on amount of D-galactosamine conjugated onto zein

由图3可知，随着玉米醇溶蛋白浓度的增加，D-氨基半乳糖导入量总体呈先增加后减小的变化趋势，在底物浓度为2%～4%范围内，糖基导入量的变化幅度较小。当玉米醇溶蛋白浓度为3%时，糖基的导入量达到最大，为10.15 mg/g蛋白。当底物浓度在1%～2%范围内，随着底物浓度的提高，底物浓度与酶促反应速率成正比，从而有利于糖基的导入；但是，当底物浓度进一步增加，酶促反应速率不再增加，表现为0级反应，说明酶已被底物所饱和。但当玉米醇溶蛋白的浓度增加到5%时，反应体系中不溶性的颗粒太多，阻碍了反应物的扩散，使糖基化反应的进行受阻，接糖量下降。综合考虑，选择最适的底物浓度为3%。

2.1.4 D-氨基半乳糖添加量对玉米醇溶蛋白糖基化反应的影响

在反应初始pH 7.5、反应温度37 ℃、底物浓度3%、TGase添加量60 U/g蛋白、反应时间8 h的条件下，研究酰基供体和酰基受体摩尔比即D-氨基半乳糖添加量对玉米醇溶蛋白中糖基接入量的影响，实验结果见图4。

图4 D-氨基半乳糖添加量对玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影响Fig.4 Effect of D-galactosamine concentration on amount of D-galactosamine conjugated onto zein

由图4可知，随着D-氨基半乳糖添加量的增加，玉米醇溶蛋白中糖基的导入量呈先增加后减小的变化趋势。当D-氨基半乳糖添加量较低时(酰基供体与受体摩尔比为1∶1)，D-氨基半乳糖与玉米醇溶蛋白分子碰撞的机率较小，因而D-氨基半乳糖的导入量较小。当增大D-氨基半乳糖的添加量(酰基供体与受体摩尔比为1∶3)时，糖基的导入量达到最大，达10.74 mg/g蛋白。这是因为随着D-氨基半乳糖添加量的增加，蛋白质分子与氨基糖分子之间的碰撞机率增加，有利于糖基化修饰反应的进行；继续增加D-氨基半乳糖的添加量不会增加玉米醇溶蛋白的D-氨基半乳糖导入量，可能是位点竞争性抑制或空间位阻的影响，不利于糖基化修饰反应的进行。因此，选择酰基供体与酰基受体的摩尔比为1∶3。

2.1.5 TGase添加量对玉米醇溶蛋白糖基化反应的影响

在反应初始pH 7.5、反应温度37 ℃、底物浓度3%、酰基供体与酰基受体的摩尔比1∶3、反应时间8 h的条件下，研究不同TGase添加量对玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影响，实验结果见图5。

图5 TGase添加量对玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影响Fig.5 Effect of TGase additive amount on amount of D-galactosamine conjugated onto zein

由图5可知，随着酶添加量的增加，D-氨基半乳糖的导入量呈先增加后减小的变化趋势。当酶添加量为60 U/g蛋白时，糖基的导入量达到最大，为10.24 mg/g蛋白，再继续增大TGase的添加量，D-氨基半乳糖的导入量呈逐渐降低的变化趋势。由米氏方程可知，当底物浓度一定时，酶促反应速率与酶浓度成正比。但是，当玉米醇溶蛋白分子上D-氨基半乳糖结合位点饱和之后，再继续增加酶量，接糖量也不会再增加。同时，反应体系中酶的浓度过高，加大了玉米醇溶蛋白分子自交联的程度，形成的大分子多聚物的较大空间位阻减少了D-氨基半乳糖与底物结合位点接触的机率，从而影响了玉米醇溶蛋白与糖基的交联，因此，确定TGase的最适添加量为60 U/g蛋白。

2.1.6 反应时间对玉米醇溶蛋白糖基化反应的影响

在反应初始pH 7.5、反应温度37 ℃、底物浓度3%、TGase添加量60 U/g蛋白、酰基供体和酰基受体摩尔比1∶3的反应条件下，研究不同反应时间对玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影响，实验结果见图6。

图6 反应时间对玉米醇溶蛋白中D-氨基半乳糖接入量的影响Fig.6 Effect of reaction time on amount of D-galactosamine conjugated onto zein

由图6可知，随着糖基化反应时间的延长，玉米醇溶蛋白与D-氨基半乳糖的糖基化程度呈先升高后降低的变化趋势。在反应10 h时，接糖量最大，即糖基化反应时间最佳；低于10 h时，玉米醇溶蛋白与氨基半乳糖反应不完全；大于10 h时，接糖量开始降低，分析有3个方面的原因：①反应时间的延长，使TGase催化形成蛋白-蛋白交联大分子和蛋白-糖多聚物的可能性加大，造成空间位阻大而阻碍了糖基的导入；②随着酶反应时间的延长，TGase的催化活力逐渐降低，酶促反应速度降低；③反应进行一定时间后，底物不足，影响了酶促反应的进行。所以，选择D-氨基半乳糖糖基化修饰玉米醇溶蛋白的最佳反应时间为10 h。

2.2 D-氨基半乳糖糖基化修饰玉米醇溶蛋白的SDS-PAGE电泳

以玉米醇溶蛋白和糖基化修饰玉米醇溶蛋白为样品，进行SDS-PAGE电泳，同时制备2块凝胶，一块进行考马斯亮蓝蛋白质染色，一块进行希夫试剂糖蛋白染色，实验结果见图7。

图7 玉米醇溶蛋白及D-氨基半乳糖修饰玉米醇溶蛋白的SDS-PAGE图Fig.7 SDS-PAGE profiles of zein and modified zein

注：A为蛋白质染色，B为糖染色；泳道1为玉米醇溶蛋白；泳道2为D-氨基半乳糖糖基化玉米醇溶蛋白。

由图7A可知，玉米醇溶蛋白含有3个主要组分，分别是分子量为45000 Da的聚合物、分子量为23930 Da和21968 Da的α-玉米醇溶蛋白组分。在糖基化修饰样品中，同样含有3个组分，且颜色的深浅程度也与原样玉米醇溶蛋白相同。由图7B可知，玉米醇溶蛋白被希夫试剂染成粉红色，说明玉米醇溶蛋白本身含有糖类，分析这部分糖可能是原料在进行去淀粉时产生的，以非共价键形式吸附在玉米醇溶蛋白分子上，而且这部分糖通过透析的方法不能被除去。经糖基化修饰后，α-玉米醇溶蛋白条带的颜色比原玉米醇溶蛋白深，说明糖蛋白的含量增加，但由于D-氨基半乳糖的分子量仅有215 Da，与玉米醇溶蛋白共价结合后对玉米醇溶蛋白分子量的变化影响较小。另外，在图7B中没有出现大分子量的分子内交联组分，可能是由于玉米醇溶蛋白分子中赖氨酸含量低，所以玉米醇溶蛋白分子发生的分子内交联的几率低，没有检测到。因此，SDS-PAGE结果证实了D-氨基半乳糖与玉米醇溶蛋白共价结合形成了糖蛋白。

2.3 D-氨基半乳糖糖基化修饰对玉米醇溶蛋白部分功能性质的影响

2.3.1 D-氨基半乳糖糖基化修饰对玉米醇溶蛋白溶解性的影响

溶解性是蛋白质一个重要的功能特性，在蛋白质的生产、加工过程中有非常重要的作用。玉米醇溶蛋白因其在水中的溶解性不佳导致其在生产加工中受阻，本实验的目的是利用D-氨基半乳糖的溶解性改善玉米醇溶蛋白在水中的溶解性。以原玉米醇溶蛋白和交联玉米醇溶蛋白为双对照，在蛋白质浓度为2 mg/mL条件下，研究不同pH条件下玉米醇溶蛋白样品的溶解性，实验结果见图8。

图8 玉米醇溶蛋白及其修饰样品的溶解性Fig.8 The solubility of zein and its modified products

由图8可知，在pH 2～12范围内，玉米醇溶蛋白的溶解性较小。随着pH值的增大，玉米醇溶蛋白溶液在280 nm处的吸光值呈先降低后增大的变化趋势，在pH值为12时，溶液在280 nm处的吸光值为0.144。玉米醇溶蛋白在碱性条件下(pH 8～11)的溶解性高于酸性条件下的溶解性，且在pH 7.0时溶解度最低，推测为玉米醇溶蛋白的等电点。与玉米醇溶蛋白相比，糖基化修饰玉米醇溶蛋白的溶解性显著提高，尤其是在pH 7.0时，280 nm处的吸光值增加了0.478，这是由于D-氨基半乳糖与玉米醇溶蛋白共价结合后，糖链中亲水性羟基的引入，增加了蛋白质的亲水性，因而玉米醇溶蛋白的溶解性增加。一些研究表明，糖基化修饰能够改善蛋白质的溶解性，Jiang等利用TGase的催化作用，将氨基葡萄糖导入酪蛋白和大豆分离蛋白，均改善了蛋白质的溶解性。玉米醇溶蛋白交联样品的溶解性与玉米醇溶蛋白相差不多，可能是由于玉米醇溶蛋白几乎不含有赖氨酸，在TGase存在下发生在玉米醇溶蛋白分子间的交联反应较少，所以对其溶解性影响较小。

2.3.2 玉米醇溶蛋白及其糖基化修饰产物的表面疏水性

疏水性在蛋白质构象及与其他蛋白质的相互作用等方面具有重要的作用，并且被认为与蛋白质的功能性质密切相关。以玉米醇溶蛋白和交联玉米醇溶蛋白为双对照，对糖基化玉米醇溶蛋白的表面疏水性进行测定，实验结果见表1。

表1 玉米醇溶蛋白及其糖基化修饰产物的表面疏水性Table 1 The surface hydrophobicity of zein and its modified products

注：不同大写字母表示分析结果差异极显著(P<0.01)。

由表1可知，与未修饰玉米醇溶蛋白相比，糖基化修饰玉米醇溶蛋白的表面疏水性下降了460.8，而交联玉米醇溶蛋白的表面疏水性增加了312.14，即糖基化修饰使玉米蛋白的表面疏水性下降，而交联反应使玉米蛋白的表面疏水性增加，这与Jiang和Song的报道结果相一致。糖基的导入会降低蛋白质表面疏水性，这是由于当D-氨基半乳糖与玉米醇溶蛋白共价结合后，玉米醇溶蛋白分子的空间结构发生了变化，虽然会导致一些位于分子内部的疏水基团暴露出来，但是相对于多羟基的D-氨基半乳糖分子来说，糖基化玉米醇溶蛋白的表面疏水性降低。交联反应使表面疏水性显著增加的可能原因是TGase的作用导致了玉米醇溶蛋白结构伸展，使包埋在蛋白质分子内部的疏水性氨基酸暴露出来，因而交联玉米醇溶蛋白的表面疏水性增加。

3 结论

由于玉米醇溶蛋白不溶于水且结构稳定，限制了其在食品工业中的应用。本实验以玉米醇溶蛋白为原料，采用酶法糖基化方式对玉米醇溶蛋白进行改性，以期利用D-氨基半乳糖的溶解性改善玉米醇溶蛋白的溶解性等功能性质。SDS-PAGE法证实了D-氨基半乳糖共价结合到了玉米醇溶蛋白分子中。采用单因素实验确定了玉米醇溶蛋白与D-氨基半乳糖的最适糖基化反应条件。与玉米醇溶蛋白和交联玉米醇溶蛋白相比，糖基化修饰玉米醇溶蛋白的表面疏水性显著降低，表明其溶解性改善和体外消化性均明显改善。在此基础上，可以进一步研究糖基化修饰对玉米醇溶蛋白的生理活性和加工特性的影响，以期达到提高玉米醇溶蛋白的营养性和功能性的效果，使其应用范围更加广泛。

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