Aurora蛋白激酶抑制剂VX-680对人肝癌细胞HepG2细胞间同质黏附力和迁移能力的影响*

任本洪， 孙雪娇， 郝跃鹏， 寇俊婷， 牛仕诗， 杨成园， 王晓霞

(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室， 山西 太原 030001)

原发性肝癌是一种发病率高、侵袭性高、易转移的恶性肿瘤，死亡率居全球恶性肿瘤第2位，仅次于肺癌[1]。肝癌具有高复发的特点，有研究表明，肝癌术后1年和2年复发率分别为42.8%和38.8%[2]；5年复发率可达60%左右[3]。因此，对肝癌的发生和转移机制进行深入研究，寻求有效抑制肝癌发生发展的药物已成为当今肝癌研究的一个方向。

Aurora蛋白激酶是近年来发现的一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶， 由Aurora A、B和C 3个成员组成，它们在催化结构域中具有67%～76%的氨基酸序列同一性，仅仅在NH2末端有所不同[4]，分别发挥着不同的生物功能。近年来研究表明，在卵巢癌[5]、胃癌[6]和乳腺癌[7]中均存在Aurora激酶的高表达。研究Aurora激酶在肿瘤细胞中的作用机理，对研发肿瘤靶向药物具有重要的临床意义。例如AZD-1152(barasertib)、MLN-8237(alisertib)和VX-680(tozasertib)[8]几个Aurora蛋白激酶抑制剂已步入临床试验阶段。据报道，VX-680能够与Aurora蛋白激酶结合使Aurora A和B激酶的活性降低[9]，导致细胞分裂停止和细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长。然而关于VX-680对HepG2细胞间黏附能力及迁移能力的影响，目前尚未见文献报道。因此，本研究将有助于阐明VX-680 的作用机制，从而为临床用药提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1细胞 人肝癌细胞系HepG2由山西医科大学生物化学与分子生物学教研室保存。

1.2主要试剂 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Gibco；DMEM高糖培养基购于HyClone；琼脂粉购于北京索莱宝有限公司；VX-680购于Merck，用DMSO溶解并贮存。

2 方法

2.1细胞培养 将HepG2细胞用含10% FBS的DMEM高糖培养基于5% CO2、37 ℃培养箱中孵育培养。

2.2细胞缓慢聚集实验[10]取对数生长期细胞消化传代于培养皿中，待细胞长至70%左右时，分别向其中加入不同浓度(3.125 μmol/L，6.25 μmol/L和12.5 μmol/L)的VX-680，放于孵箱中孵育48 h；消化细胞并加入提前用琼脂铺好的96孔板中，每组设置5个平行孔，在孵箱中孵育12 h，观察细胞聚集情况，拍照并计算各组形成的细胞团数。

2.3细胞分离实验[11]取对数生长期的细胞消化传代于培养皿中，待细胞长至70%左右时，加入不同浓度(3.125 μmol/L、6.25 μmol/L和12.5 μmol/L)的VX-680作用48 h；常规消化细胞于48孔板中铺板，每组设置10个平行孔，待细胞长满时，分别用含1 mmol/L EDTA(TE)的0.2%胰酶及1 mmol/L CaCl2(TC)的0.2%胰酶处理细胞，于倒置显微镜下计数单个细胞和细胞团总数(N)，并用 NTC/NTE值来表示细胞分散程度。

2.4划痕愈合实验 常规消化不同浓度 (3.125 μmol/L、6.25 μmol/L和12.5 μmol/L) VX-680作用24 h后的HepG2细胞，使其浓度为1×109/L，接种于35 mm的培养皿中，置于细胞培养箱中培养，待细胞汇合长满后，用200 μL移液枪枪头在单层细胞上呈“一”字垂直划痕，用PBS洗2次，然后加入无血清的培养基培养，48 h后取出，倒置显微镜观察并拍照，采用Image-Pro Plus软件测量划痕宽度。

2.5Western blot 检测蛋白的表达水平 收集对数生长期细胞加入含有PMSF的细胞蛋白裂解液，冰上裂解40 min，每隔10 min轻弹1次，以防结冰，12 000 r/min 离心20 min收集上清液，提取细胞总蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。采用 SDS-PAGE 进行蛋白分离后，转至0.45 μm NC膜上，5%脱脂奶粉室温封闭3 h，加入稀释好的E-钙黏蛋白(E-cadherin)和β-actin Ⅰ抗，4 ℃摇床过夜，PBST洗膜3次，加入相应的 Ⅱ 抗室温摇床孵育2 h，PBST洗膜3次，使用ECL化学发光成像。

3 统计学处理

利用SPSS 22.0软件进行统计学分析。实验结果用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 细胞聚集实验结果

随着VX-680浓度的增加，细胞聚集形成的细胞团块数减少，体积增大，团块越来越致密；而对照组细胞聚集形成的团块较多，体积较小，且疏松。通过计数每组的细胞团数，发现对照组所形成的细胞团块数为63.67±7.2，而实验组不同浓度(3.125 μmol/L、6.25 μmol/L和12.5 μmol/L)VX-680所形成的细胞团块数分别为24.67±3.5、14.0±3.0和1.3±0.6，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)，且各实验组间差别亦有统计学意义(P<0.05)。结果表明实验组HepG2细胞间的细胞聚集能力明显高于对照组，并且聚集能力随VX-680浓度的增加逐渐增强，见图1。

Figure 1. Aggregation ability of HepG2 cells treated with VX-680 at different concentrations observed under inverted microscope. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group；△P<0.05vs3.125 μmol/L group；#P<0.05vs6.25 μmol/L group.

图1不同浓度VX-680作用HepG2细胞后的细胞聚集情况

2 细胞分离实验结果

用含1 mmol/L EDTA的胰酶处理后，VX-680各浓度组的HepG2细胞大多分散成单个，各组细胞的分散程度几乎没有差异；用含1 mmol/L CaCl2的胰酶处理后，与对照组相比，随着VX-680浓度的增加，实验组所形成的细胞团块越来越大。经计算，对照组NTC/NTE值为(0.90±0.13)；而不同浓度(3.125 μmol/L、6.25 μmol/L和12.5 μmol/L)VX-680处理组NTC/NTE比值分别为0.48±0.07、0.34±0.03和0.19±0.01，与对照组相比，具有统计学意义(P<0.01)，且各实验组间差别亦具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明，实验组细胞间的细胞黏附能力明显强于对照组，并且黏附能力随着VX-680浓度的增加逐渐增强，细胞越来越不容易被分散，见图2。

3 划痕愈合实验检测细胞迁移能力的变化

划痕愈合实验结果显示，划痕后0 h，对照组和VX-680各浓度组的划痕宽度基本相同，48 h后，对照组的划痕基本愈合，而VX-680各浓度组细胞的划痕愈合延迟，并且随着VX-680浓度的升高，细胞划痕的愈合能力逐渐降低，与对照组相比，具有统计学意义(P<0.01)，且各实验组间差别亦具有统计学意义(P<0.01)。结果表明VX-680能够抑制HepG2细胞的迁移，见图3。

4 Western blot检测VX-680的HepG2细胞中黏附分子E-cadherin的蛋白表达水平

Western blot检测结果显示，DMSO和不同浓度(3.125 μmol/L、6.25 μmol/L和12.5 μmol/L)VX-680作用于HepG2细胞24 h后，细胞中E-cadherin蛋白的表达水平随着VX-680浓度的增加而升高，差别具有统计学意义(P<0.05)，见图4。

讨 论

Aurora激酶在大多数恶性肿瘤中均存在高表达，如乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、食管癌和胰腺癌等。Aurora激酶的过表达可以促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡。VX-680可以抑制Aurora激酶的活性，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡[12]。

Figure 2. Dissociation of the HepG2 cells treated with different concentration of VX-680. A: the dissociation ability of the HepG2 cells detected by the method of exposure to trypsin in the presence of EDTA or CaCl2(×200); B: the cell dissociation index (NTC/NTE). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group；△P<0.05vs3.125 μmol/L group；#P<0.05vs6.25 μmol/L group.

图2不同浓度VX-680作用的HepG2细胞分离情况

Figure 3. The effects of VX-680 at different concentrations on the migration ability of HepG2 cells. A: the representative pictures of wound healing assay (×100); B: the scratch width of HepG2 cells treated with VX-680 at different concentrations. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group；△P<0.05vs3.125 μmol/L group；#P<0.05vs6.25 μmol/L group.

图3不同浓度的VX-680对HepG2细胞迁移的影响

Figure 4. The protein levels of E-cadherin in the HepG2 cells treated with VX-680 at different concentrations. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.05vs3.125 μmol/L group;#P<0.05vs6.25 μmol/L group.

图4不同浓度的VX-680作用下HepG2细胞中E-cadherin蛋白表达水平

肿瘤的发生和发展往往与细胞行为的改变有关。大量的研究显示，肿瘤细胞间黏附力的下降是造成肿瘤细胞发生迁移和转移的首要原因，钙黏蛋白是一类主要介导细胞间同质黏附的钙依赖性跨膜糖蛋白，其中上E-cadherin能以嗜同性方式(同种分子间拉链式结合)介导同型细胞与细胞间的黏附。当E-cadherin失活时，可以促进肿瘤细胞脱离原发灶发生转移[13]。本实验主要采用细胞缓慢聚集实验和分离实验阐明了VX-680对人肝癌细胞HepG2细胞间黏附能力的影响。细胞缓慢聚集实验主要是通过用琼脂包被培养皿的方式模拟细胞在悬浮状态下发生聚集的情况，通过显微镜下观察细胞聚集成细胞团块的大小、数量，来判断细胞间黏附力的强弱。细胞间黏附力强，所形成的细胞团块数少，团块较大且紧密。细胞间黏附力降低时，所形成的细胞团块相对多，团块较小且疏松[14]。细胞分离实验主要是基于E-cadherin对Ca2+的依赖性而设计的。首先，我们分别用含EDTA(TE)及 CaCl2(TC)的胰酶处理细胞。用含EDTA(TE)的0.2%胰酶处理细胞后，由于EDTA可以螯合金属阳离子Ca2+而抑制Ca2+依赖型钙黏蛋白E-cadherin所介导的细胞与细胞间黏附，使细胞间连接破坏，细胞分散为单个细胞。用含CaCl2(TC)的0.2%胰酶处理细胞后，由于Ca2+的存在E-cadherin的黏附功能可以正常发挥，单层细胞被分散为单个细胞的能力减弱，细胞团块增多。也就是说，随着E-cadherin功能的增强，细胞越来越不容易被分散为单个细胞。因此可以用NTC/NTE来反映E-cadherin的功能[15-18]。NTC/NTE值越小，E-cadherin的功能越强，细胞间黏附能力越强。通过细胞缓慢聚集实验和细胞分离实验我们发现，相比对照组，实验组细胞的细胞聚集能力明显增强，细胞的分散能力显著降低；并且随着VX-680浓度的升高，细胞间的聚集能力逐渐增强。Western blot实验结果也证实HepG2细胞中E-cadherin的表达随着VX-680浓度的升高而增加。另外，划痕实验结果表明，VX-680可以抑制HepG2细胞的迁移。

综上所述，Aurora蛋白激酶抑制剂VX-680能够增强人肝癌细胞HepG2细胞间的同质黏附力，抑制肿瘤细胞的迁移。

[参 考 文 献]

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