Catsperg1基因在大鼠睾丸发育中转录表达的分析*

韦龙生 韩 璐 杨 铮 王丽佳 王羚鸿 刘陶迪** 张信来

1.内蒙古医科大学心身医学研究室（内蒙古呼和浩特 010110）；2.山西医科大学汾阳学院；3.内蒙古医科大学附属医院普外科

Abstract ObjectiveTo study the transcriptional expression ofCatsperg1in the development of rat testes and its effect on sperm maturation.MethodsMale Wistar rats at 21 time points of age (frome 2 to 65 days) were given, and their testis tissues at three different litter were collected at each time point.Total mRNA was extracted from rat testis tissues and reverse transcribed into cDNA, and then amplified for detection the transcription expression ofCatsperg1by real-time PCR.ResultsThe mRNA expression ofCatsperg1began to increase slowly at the 20th day after birth, reached the peak at the 50th and 55th day, and remained at the peak at the 60th and 65th day.ConclusionThe expression ofCatsperg1in rat testis gradually increased, which may be involved in the regulation of sperm maturation.

Key wordsCatsperg1; gene expression; spermatogenesis; rats; sperm maturation

近年来，不育不孕的发病率逐年提高，困扰着许多已婚夫妇，其中男方因素约占百分之五十，导致男性不育的原因有很多，其中包括精液异常、生精障碍、输精管梗阻和全身性因素（精神和环境因素、营养因素、内分泌疾病），其中生精障碍是引起男性不育的重要原因。

精子发生的分子机制是当前精原干细胞研究的热点。尽管参与精子发生的众多基因有许多生物学特征[1]，但在基因转录表达峰值方面主要体现在三个阶段：第一，有丝分裂阶段，即出生后0～8d，此时精原干细胞以增殖为主；第二，减数分裂开始，即出生后14d左右，此时初级精母细胞出现；第三，进入精子发生之后，即出生20d之后，此时圆形精子首次出现[2,3]，出生35d后完成圆形精子向长形精子的变形，成熟的精子出现。出生56d后大鼠性成熟，达到成年状态[4,5]。

大鼠中的Catsperg1基因，也叫Catsperg基因，两者为同源性基因。Catsperg基因是Catsper精子钙通道上的一个亚基[6]，是精子超激活运动和男性生育能力所必需的基因,精子细胞过度活化可能是通过Catsper1，精子细胞过度活化是精子活力所必需的，精子活力是精子受精过程所需条件。

本实验通过Real-time PCR技术，检测大鼠睾丸组织Catsperg1基因的mRNA表达情况，为进一步研究该基因的蛋白表达情况提供依据，从而研究该基因在精子功能中的作用。

材料与方法

一、材料

总RNA提取试剂盒（DP419）购自TIANGEN公司，反转录及实时定量PCR试剂从大连宝生物公司购买，引物由上海生物工程公司合成。

二、实验动物

从内蒙古大学购买出生10周左右的Wistar大鼠，并在内蒙古医科大学动物中心饲养，将雄鼠与雌鼠合笼，自然交配，每周换垫料1次，保持饲料和饮水的干净和充足。第8天后分笼，第18～20天后开始每天观察雌鼠3次，记录鼠出生的具体时间。出生当天记成第1天（1日龄），编号饲养。

三、实验样本采集

将出生后2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65日龄的雄鼠用脊椎脱臼法处死，取睾丸组织，每个日龄取3只不同窝别的大鼠。

1.各个时间点总RNA的提取

取出的睾丸组织按照总RNA提取试剂盒（TIANGEN，DP419）上的使用说明书进行操作，从总的RNA管中分装出2μL在超微量紫外分光光度仪（ Thermo ND 2000L）测定其RNA浓度(Conc)和纯度(A260：A280比值)，RNA浓度测3次取其平均值，A260/A280比值保持在1.95～2.10之间。总的RNA管放入-80℃冰箱保存。

四、RNA反转录为cDNA

规定稀释后每管样品质量为1μg，浓度为0.15μg/μL，根据测得样品的RNA浓度，可以计算出所需mRNA体积。反转录体系为20μL， A液10μL（稀释后RNA 6.67μL，10μm oligo-dt 1μL，RNase-Free dH2O 2.33μL），B液10μL（5×RT-MMlV Buffer 4μL，dNTPs(10mM)2μL，RRI(10μ/μL)1μL，RT-M-Mlv 0.5μL，RNase-Free H2O 2.5μL），A液65℃水浴5min，B液与A液混合后42℃水浴1h，70℃水浴10min，最后-20℃保存。

五、Catsperg1基因引物设计

引物序列见表1。

表1 寡核苷酸引物列表

六、Real-time PCR方法检测Catsperg1的转录表达

以该 cDNA 为模板对部分Catsperg1片段进行扩增，在8×12的96板孔中，在每个孔20μL的反应液总体积中依次加入下列物质：RNase-Free dH2O 7μL，两个引物各0.8μL，Extaq酶 10μL，Rox 0.4μL，cDNA 1μL，按照第2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天的21个时间点的cDNA依次加入反应液，每个时间点反应液重复一次，并带两个相应时间点的GAPDH的反应液，GAPDH做内参对照，H2O做阴性对照，采用Ct方法分析Catsperg1mRNA的表达量，结果用基因mRNA相对表达倍数表示，计算方法用2-ΔΔCt法，数据和图表使用Microsoft Excel软件分析[7]。

结 果

一、Real-time PCR检测Catsperg1基因在三组不同窝别大鼠早期发育睾丸组织中mRNA水平的表达情况

根据引物的溶解曲线可知，重合度高，其特异性好（图1A，图1C）。扩增曲线在PCR平台期几乎重合（图1B，图1D）。

通过Real-time PCR反应检测到Catsperg1基因在3组不同窝别的大鼠出生后第2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天睾丸组织中的表达模式（图2），3组不同窝别的大鼠睾丸组织mRNA水平表达趋势基本一致；第2天至第65天的大鼠睾丸组织mRNA表达差异明显。Catsperg1mRNA表达在第2天到第16天几乎没有，到第20天开始逐渐增加，到第29天达到一个小高峰又逐渐下降到第30天，之后从第30天到65天表达再次迅速升高，形成一个高峰，并维持一定峰值。

图1 Catsperg1和Gapdh的溶解曲线和扩增曲线

图2 Catsperg1基因在3组不同窝别大鼠出生后第2天至第65天睾丸组织中mRNA的相对表达量

讨 论

哺乳动物精子发生是一种细胞分化的连续体，其中可以分为3个主要阶段：精原细胞的增殖，减数分裂和精子形成。精子发生由干细胞（原始型A型精原细胞）的分裂引发，Ap型精原细胞分化增殖为两个 B 型精原细胞。B型精原细胞分裂增殖为初级精母细胞，精母细胞经历了减数分裂的不同阶段，第一次分裂后形成次级精母细胞，染色体数目减少一半，第二次分裂后形成圆形精子细胞， 随后，圆形精子细胞经过复杂显著的形态变化，形成延长的精子细胞，然后发育为成熟精子[2]。这种复杂的过程由数千个基因在生殖细胞发育的特定阶段选择性表达。在精子发生过程中，这些基因的表达在精子发生过程起调控作用。转录和翻译控制机制负责时间和阶段特异性表达模式[8,9]。

Catsperg1基因是Ca2+通道蛋白家族之一[10,11]，据相关研究报道该基因位于哺乳动物精子膜表面的Ca2+通道，负责胞内外 Ca2+浓度的调节，调控精子活力、超活化、精子获能和顶体反应等生理过程[12-14]。Catsperg1基因是Catsper精子钙通道上的一个亚基[6]，而Catsper精子钙通道是具有电压依赖性，Ca2+选择性，pH敏感性。它控制带正电Ca2+进入精子细胞，这是精子过活化和男性生殖力所必需的[15,16]。

本实验通过对Catsperg1基因在大鼠出生后第2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天的表达模式的检测，可以观察到，Catsperg1基因在大鼠出生早期，几乎不转录，直到第20天mRNA表达才开始增加，在第29天有个小高峰，之后从第30天表达又逐渐增加，在第50天表达达到最高值，之后维持一定峰值。第20天正好是圆形精子出现的时间点，20d到65d，圆形精子经过复杂的变态发育后形成成熟的精子，因此可以推测Catsperg1基因可能与精子成熟有关，并在其中发挥重要的作用。

通过上述实验结果可以总结以下结论：（1）Catsperg1基因表达与精子发生有相关性；（2）Catsperg1基因在大鼠睾丸组织中晚期发育的表达量逐渐升高，可能参与精子成熟。本实验揭示了Catsperg1基因与精子有相关性，为下一步对该基因的功能研究奠定了基础。

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