银杏内酯B对于实验性脑出血后神经保护作用研究

郑家地 郑红花 聂立铭

脑出血后，炎症反应和自由基损伤等可以导致细胞钙超载，最终造成神经损伤，银杏内酯B具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，本研究观察银杏内酯B对实验性脑出血大鼠神经细胞水肿、细胞凋亡、脑代谢的影响，探讨银杏内酯B对于脑出血后神经保护作用的可能机制。

1.资料与方法

1.1 主要试剂及设备 Ⅶ型细菌胶原酶(SIGMA USA)，银杏内酯B(ABSIN)，细胞凋亡试剂盒由PROMEGA生物工程有限公司提供(Cat#7360),9.4T磁共振(BRUKER,瑞士)，KOPF型大鼠脑立体定位仪(美国KOPF公司)，微量注射器(上海飞鸽医疗器械有限公司)，牙科钻，手术器械等。

1.2 研究方法

1.2.1 脑出血模型的建立：健康雄性SD大鼠，由厦门大学实验动物中心提供，体重250～300g，4%水合氯醛(400mg/kg)溶液腹腔注射麻醉，将大鼠俯卧位固定在立体定向仪上(KOPF USA)，根据大鼠大脑立体定位图谱调整立体定向仪使门齿沟平面比耳间线平面低3.3mm,前囟和后囟基本上在同一平面上，将头部背侧的鼠毛剪去，皮肤消毒后纵行切开头皮1cm，暴露颅骨，用30%双氧水腐蚀颅骨上腱膜及颅骨外膜，暴露前囟；于前囟后0.2mm，中线右旁3mm，用牙科钻钻一直径约1mm的圆孔；钻孔后将0.4units的Ⅶ型细菌胶原酶(SIGMA,USA)溶于1μl生理盐水中，采用微量加样器沿钻孔方向垂直进针5.0mm，使用缓慢推进器匀速将其推注入脑，术毕用石蜡封闭骨口，严密缝合皮肤切口，待动物苏醒后送回动物房饲养。

1.2.2 脑含水量检测：麻醉后断头取脑:将其从大脑纵裂切开，然后平均分成前中后三块并称其湿重，置于95℃烘箱中烘烤至恒重后称取干重，根据下式计算脑组织含水量:(湿重-干重)/湿重×100%;取平均值做统计学分析。

1.2.3 脑组织凋亡细胞的检测：采用TUNEL(terminal deoxynucleotidy1 transferase mediated dUTP nick-end-labeling)法,操作按试剂盒说明书进行,试剂盒由PROMEGA生物工程有限公司提供(Cat#7360),高倍镜下(400倍)细胞核呈棕黄色着色为凋亡阳性细胞。高倍镜下在双侧纹状体区各随机取5个视野,计数阳性细胞。阳性对照用1mg/L DNA酶I 37℃孵育10分钟,缓冲液中含有50mmol/L Tris,10mmol/L MgSO4,0.1mmol/L DTT,蒸馏水冲洗。阴性对照:以磷酸盐缓冲液(PBS)代替DNA末端标记中的末端脱氧核苷酸转移酶及生物素标记的dUTP。

1.2.4 MRI参数及后处理方法：采用BRUKER 9.4T超导MR成像系统，并用EWS影像后处理工作站处理图像，4通道大鼠专用线圈。大鼠麻醉后仰卧位，头置于线圈中央，毛巾覆盖体表保温。MRS：点分辨自旋回波波谱(point-resolved spectroscopy，PRESS)刺激回波采集样式(stimulated echo acquisition mode，STEAM)，在T2横断位像定位，置于尾壳核层面(包括脑出血区及其周围区)，体素容积为3×3×3mm，扫描前自动匀场，采集时间为20分钟，在右侧脑出血区周围选取4～7mm2感兴趣区，统计该区域的各代谢物波峰下面积。

1.2.5 干预组处理方法：干预组大鼠按20mg/kg银杏内酯B腹腔每日注射1次。对照组大鼠注射同体积的生理盐水。所有大鼠放回笼中常规喂养。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，符合正态分布采用两样本t检验，非正态分布采用Wilcoxon非参数检验；两组间比较采用单因素方差分析One-Way ANOVA，多组间比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 脑出血模型的建立及大鼠追尾征 本研究中建立的大鼠脑出血模型，均有左侧肢体活动障碍，呈现追尾征。3天内干预组及对照组各死亡1只，死亡时段数据缺失，其余大鼠功能障碍随着银杏内酯B的应用，偏瘫症状得到改善。

2.2 脑组织含水量检测 对照组[(82.52±0.86)%]与干预组[(81.45±0.54)%]比较，具有显著性差异(P<0.05)。

2.3 细胞凋亡检测 脑细胞凋亡检测，干预组(52.47±2.66)与对照组(44.22±3.11)比较，具有显著性差异(P<0.05)。见图1。

2.41H-MRS检测结果

2.4.1 假手术组：假手术组MRS波形基本与脑组织磁共振波谱曲线相同，NAA峰最为明显；Cr与Cho峰曲线下面积相近；Lac峰大部分未见。

图1 第3天干预组与对照组细胞凋亡情况

2.4.2 干预组与对照组：干预组与对照组的第1天、第3天在脑血肿周围均可见到NAA下降，但两组在第1天NAA的浓度及Lac浓度均差异无显著意义(P>0.05)，在第3天、第7天，干预组的Lac浓度均较对照组明显降低(56.78±3.22比66.47±3.56，50.33±4.05比55.78±4.07；均P<0.05)，而胆碱复合物(Cho)、肌酸(Cr)虽然浓度略有变化，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、表2。

表1 干预组与对照组各时间点NAA与Lac浓度比较

表2 干预组与对照组各时间点Cho与Cr浓度比较(mmol/L)

3.讨论

银杏内酯B(GB)为一种强力的血小板活化因子受体拮抗剂，其具有抗血小板聚集、抗炎、抗凋亡、免疫调节等作用，并且毒副作用低，作为神经保护剂应用于临床[1]，其保护机制有待进一步阐明，是目前研究热点之一。脑出血后血肿周围存在继发性神经损伤，包括脑水肿、细胞凋亡、自由基损伤等。应用GB能明显降低脑出血大鼠的神经功能障碍，减轻脑出血后脑水肿;并且凋亡减轻，超微结构明显好转[2]，GB也能使脑梗死面积含水量明显降低，对局灶性脑缺血大鼠有直接的神经保护作用，这些研究结论与本研究结果基本一致[3]。体外实验证实，GB可以拮抗谷氨酸诱导的培养脑皮质神经细胞凋亡[4]。有研究发现，GB可以拮抗谷氨酸诱导的视网膜神经细胞凋亡，其作用机制可能与提高线粒体膜机能有关[5]。也有研究发现在小鼠胚胎干细胞中，GB激活JNK，caspse3和PAK2产生抗凋亡效应。总之，GB可能通过降低体内自由基和炎症反应影响多条信号通路，从而抑制脑出血后神经细胞凋亡，达到神经保护作用。

磁共振波谱(MRS)为一种无创性研究活体组织生化代谢的影像技术，利用MR现象和化学移位作用进行特定原子核及化合物的定量分析，已经成为研究蛋白质、核酸、多糖等生物大分子及组织、器官活体状态的有力工具。近年来对MRS研究显示[6]，MRS可检测的脑组织的代谢产物主要有NAA，Lac，Cho和Cr。NAA可以作为反映神经元功能状况的内标物，被认为是神经病理状态的生化标志。NAA降低提示神经元和突触的损失及功能异常，但仅有脑功能失调而无神经元死亡也可引起NAA的显著丢失[7]。Lac可反映无氧酵解的情况，当脑缺血、氧供减少、无氧酵解率增加时，Lac含量亦增加[8]。Cho峰及其含量增加可能是细胞合成或分泌量增加的反映。Cr峰是能量代谢的一种产物，通常将Cr作为参照波峰，进行半定量分析。

本研究表明，GB3天亚组和7天亚组的N-乙酰天门冬氨酸(NAA)较对照组明显升高(34.56±2.76比26.78±3.26，62.66±2.79比56.34±1.32；均P<0.05)，乳酸明显降低(56.78±3.22比66.47±3.56，50.33±4.05比55.78±4.07；均P<0.05)，而胆碱复合物、肌酸差异无统计学意义(P>0.05)。关于Cho和Cr，不同研究得到的结论也不相同[9]。Cr是能量的缓冲剂，一般比较稳定，当患者能量代谢不足时，其含量增加；如石金河[10]等指出，肌酸激酶与脑血管疾病密切相关，间接反映脑组织能力代谢的变化[11，12]。

综上所述，GB可以通过减少脑组织含水量、减少细胞凋亡、改善脑代谢，从而起到神经保护作用，也可以通过抗炎、对星形胶质细胞的保护、抑制兴奋性诱导的神经元损伤、免疫调节、在多种疾病的模型中发挥神经保护作用，但其神经保护效应的内在完整机制还有待于更多实验来探寻。

参考文献

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