microRNA-376c在人结直肠癌组织中的表达水平及其与临床特征和预后的关系

袁伟，马肖，马洁

1国家癌症中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室，北京 100021

2北京医院生物治疗中心/国家老年医学中心，北京 100730

结直肠癌是常见的恶性消化道肿瘤，中国结直肠癌的发病率和病死率在全部恶性肿瘤中均居前5位[1]。晚期结直肠癌患者的术后5年总生存率仍不理想，仅有15%[2]。寻找预测结直肠癌进展及预后的标志物对结直肠癌患者的个体化治疗以及延长患者的生存期具有重要意义。微小RNA（microRNA，miRNA）已被证明几乎参与肿瘤发生、发展的各个阶段，并且可以作为预测肿瘤患者病情进展及预后的标志物[3]。在本研究组的前期研究中利用miRNA芯片在结直肠癌组织及相应的癌旁正常组织中筛选出多个差异表达的miRNA，并且发现这些miRNA与结直肠癌患者的临床分期、淋巴结转移、预后相关[4-7]，其中包括miRNA-376c。miRNA-376c属于miRNA-376家族成员，定位于人类14号染色体长臂32区，已被证实参与多种肿瘤，如骨肉瘤、肺癌、宫颈癌、口腔癌的发生发展过程[8-11]，如通过抑制靶基因TGFA，进而抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭[8]，通过靶向BMI1抑制口腔癌细胞的增殖、迁移，并促进其凋亡[11]。miRNA-376c的表达水平与口腔癌患者的临床特征，如TNM分期、分化程度以及淋巴血管侵犯相关，提示其可作为预测口腔癌患者病情进展的标志物[11]。然而miRNA-376c在结直肠癌中尚未有研究，其在结直肠癌组织中的表达水平尚未明确。本研究使用实时荧光定量PCR的方法验证了202例结直肠癌组织及相应癌旁正常组织中miRNA-376c的表达水平，并分析其与结直肠癌患者临床特征的关系以及与患者预后的关系，初步提示miRNA-376c有可能作为预测结直肠癌患者病情进展以及预后的标志物。

1 材料与方法

1.1 标本采集

本实验所用的组织标本均来自2011年3—12月于中国医学科学院肿瘤医院接受治疗的202例结直肠癌患者，术中取患者的新鲜结直肠癌组织标本及相应的癌旁正常组织标本，采集后立即放入液氮中冷却，于-80℃冰箱保存。所有患者均经病理检查确诊为结直肠癌，且患者手术前均未接受化疗或放疗。202例患者中，男117例，女85例；年龄﹤60岁98例，≥60岁104例；肿瘤直径﹤5 cm 104例，≥5 cm 98例；肿瘤位置：结肠92例，直肠110例；分化程度：高分化10例，中分化172例，低分化20例；有淋巴结转移99例，无淋巴结转移103例；TNM分期：Ⅰ期35例，Ⅱ期66例，Ⅲ期83例，Ⅳ期18例。按照有无淋巴结转移，将结直肠癌组织分为A组（癌伴淋巴结转移，n=99）和B组（癌无淋巴结转移，n=103），将癌旁正常组织分为C组（癌旁伴淋巴结转移，n=99）和D组（癌旁无淋巴结转移，n=103）。本研究获得本院伦理委员会批准（批号为NCC2013-093），所有患者均知情同意，并签署知情同意书。

1.2 主要试剂

miRNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、定量PCR试剂盒、miRNA-376c和内参照U6的特异性引物均购自德国Qiagen公司。

1.3 miRNA的提取和检测

miRNA的提取严格按照miRNeasy mini试剂盒的操作步骤进行。提取结直肠组织总RNA，应用紫外分光光度计检测提取的miRNA的浓度和纯度，根据RNA浓度计算用于逆转录实验的RNA体积。按照Qiagen逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录成cDNA，反应条件为37℃60 min、95℃5 min。取逆转录产物为模板，利用Qiagen定量PCR试剂盒、miRNA-376c和内参照U6的特异性引物，按照说明书中的反应体系进行实时定量PCR检测，所有反应均设置3个复孔。反应条件为95℃15 min，94℃ 15 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，共45个循环。采用Lightcycler 480实时定量PCR仪进行检测，以U6为内参照计算相对表达水平，反应体系中荧光信号达到阈值的循环数为Ct，相对表达量以-△Ct来表示，计算公式为-△Ct=CtU6-CtmiRNA-376c。-△Ct值越高表明miRNA-376c相对表达量越高。

1.4 随访情况

采用电话的方式对患者进行术后随访，随访截止时间为2015年9月12日，随访时间为5～45个月。202例患者中，156例患者获得有效随访，随访率为77.2%。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，多组间任意两组比较采用LSD-t检验；计数资料以率（%）表示，组间比较采用交叉表分析。生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-376c在不同组织中的表达情况

实时荧光定量PCR结果显示：miRNA-376c在结直肠癌组织中的相对表达量为（-10.918±0.101），明显低于癌旁正常组织的（-9.700±0.103），差异有统计学意义（t=8.50，P﹤0.01）。方差分析结果显示：A、B、C、D四组中miRNA-376c的相对表达量比较，差异有统计学意义（F=28.22，P﹤0.01）；其中，A组中miRNA-376c的相对表达量明显高于B组[（-10.620±0.136）vs（-11.230±0.143）]，差异有统计学意义（P﹤0.01），详见图1。miRNA-376c在Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期结直肠癌组织中的相对表达量逐渐升高，分别为（-11.230±0.143）、（-10.790±0.147）、（-9.848±0.300），差异有统计学意义（F=8.22，P﹤0.01），详见图2；而miRNA-376c在不同分期患者的癌旁正常组织中的相对表达量比较，差异无统计学意义（P﹥0.05）。

图1 miRNA-376c在结直肠癌组织及癌旁正常组织中的表达水平

图2 miRNA-376c在不同分期患者结直肠癌组织中的表达水平

2.2 miRNA-376c表达水平与结直肠癌患者临床特征的关系

以miRNA-376c在结直肠癌组织中表达水平的中位数（-11.08）为截点，将202例患者分为miRNA-376c高表达组（n=101）和miRNA-376c低表达组（n=101）。miRNA-376c在结直肠癌组织中的表达与结直肠癌患者的分化程度、淋巴结转移、TNM分期均有关（P﹤0.05），其中高表达miRNA-376c的结直肠癌患者的分化程度低、淋巴结转移率高、TNM分期较差。而miRNA-376c在结直肠癌组织中的表达与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤部位及肿瘤大小无关（P﹥0.05）。（表1）

2.3 miRNA-376c表达水平与结直肠癌患者预后的关系

Kaplan-Meier生存分析显示：miRNA-376c高表达组和低表达组患者术后随访45个月的生存率分别为75.64%和89.74%；miRNA-376c高表达组患者的总生存期明显短于miRNA-376c低表达组，差异有统计学意义（χ2=5.61，P﹤0.05）。（图3）

3 讨论

miRNA被证明在肿瘤的发生、发展中扮演着重要角色，并且可以作为肿瘤的早期诊断、靶向治疗以及预后的潜在标志物。以往的研究表明，miRNA-376c在不同的肿瘤中发挥着不同的作用，如在骨肉瘤、肺癌、宫颈癌以及口腔癌中miRNA-376c表达下调，并且可以作为抑癌基因抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭等生物学特性[8-11]。同时，在头颈鳞癌、前列腺癌以及胃癌组织中miRNA-376c表达上调[12-14]，并且可以作为促癌基因促进头颈鳞癌和前列腺癌细胞的转移[12-13]。

表1 miRNA-376c表达水平与结直肠癌患者临床特征的关系[n（%）]

图3 miRNA-376c高表达与低表达结直肠癌患者的生存曲线

miRNA-376c在结直肠癌中尚未有研究报道，其在结直肠癌中的表达以及能否参与结直肠癌患者的病情进展尚不可知。本研究检测了202例结直肠癌患者的结直肠癌组织以及相应的癌旁正常组织中miRNA-376c的表达水平，并发现了高表达水平的miRNA-376c与结直肠癌患者的高TNM分期、低分化、淋巴结转移以及不良预后相关，这表明miRNA-376c可能在结直肠癌的发展过程中起到了促癌作用。但miRNA-376c在结直肠癌组织中的表达水平低于癌旁正常组织，说明其在结直肠癌发生的早期阶段可能又起到了抑癌基因的作用。这种角色的转变可能是由于其在不同的阶段作用的下游靶基因不同而造成的。目前，已证实的miRNA-376c的靶基因有TGFA、LRH-1、RUNX2、MMP2和ARID4A等[8-9,12-14]，分别参与不同肿瘤细胞的增殖和侵袭过程。MiRNA-376c在结直肠癌的发生、发展阶段可能作用于不同的靶基因，其机制有待以后进一步探讨。

miRNA被认为能够与一些常用的标志物（如CA19-9）联合用于肿瘤的早期诊断，这在本研究组的前期研究结果中也有报道[15]。miRNA-376c在胃癌患者的血浆中表达上调，表明其可能作为诊断早期胃癌的潜在标志物[14]。miRNA-376c在结直肠癌患者血浆中的表达情况有待进一步验证。

综上所述，在结直肠癌的不同发展阶段，miRNA-376c的表达水平不同，并且其与结直肠癌患者的分化程度、TNM分期、淋巴结转移以及预后相关，提示miRNA-376c有可能作为指示结直肠癌患者病情进展的标志物。

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