上调miRNA-335表达对肺癌细胞增殖、凋亡及对survivin表达的影响

高立伟，兰守丽，闫江涛，左一凡，武素芳，张晖

平煤神马医疗集团总医院肿瘤二区（胸部肿瘤科），河南 平顶山 467000

肺癌是常见的呼吸系统恶性肿瘤，近年来，其发病率呈逐年上升的趋势[1-2]。肺癌的发生及发展是一个多基因、多阶段的过程，因此，研究肺癌的发病原因及发病机制具有重要的意义。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是在生物体内发现的由19～25个核苷酸组成的一类小分子RNA，近些年来在肿瘤中的作用已受到广泛关注，已有多项研究显示，miRNA与肺癌的发生发展、预后及诊断治疗关系密切，如低表达的miRNA-21可以抑制肺癌细胞的增殖及分化，并促进细胞的凋亡[3-4]；外周血中miRNA-143的含量可用于非小细胞肺癌的早期诊断及预后判断[5]。miRNA-335定位于人染色体7q32.2，研究显示，miRNA-335在乳腺癌、肺癌中呈现低表达，其高表达可降低肿瘤细胞的转移及侵袭能力[6]。而miRNA-335在结肠癌中呈现高表达，可促进肿瘤细胞的转移及侵袭，说明miRNA-335在不同肿瘤组织中发挥着不同的作用[7]。为了研究miRNA-335在肺癌中的作用，笔者利用miRNA-335的模拟物mimics转染A549细胞，观察细胞的增殖及凋亡情况，并进一步研究其作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺癌A549细胞购自郑州大学实验室。胎牛血清、RPMI1640培养基均购自美国Gibco公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒、细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙锭（PI）试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；RNA提取试剂盒、LipofectamineTM2000试剂均购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒购自日本Takara公司；survivin、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体均购自美国Abcam公司；酶标仪、流式细胞仪均购自美国Bio-Rad公司；PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司。

1.2 细胞培养及转染

人肺癌A549细胞在37℃、5%CO2、95%饱和湿度的恒温孵育箱中用含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养基传代培养。每2～3天换液1次，细胞生长至80%融合时进行转染。转染分为3组，即对照组（不作任何处理）、空转染组（转染空载体）、过表达组（转染miRNA-335 mimics）。转染严格按照LipofectamineTM2000转染说明进行操作。

1.3 RT-PCR检测转染效果

采用反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）检测转染效果。取转染48 h的上述3组细胞，采用Trizol法提取细胞中的总RNA，逆转录试剂盒反转录总RNA为cDNA。参照GenBank中的基因序列，利用Primer premier 6.0引物设计软件设计目的基因miRNA-335及内参基因U6的RTPCR引物，以cDNA为模板，应用实时荧光定量PCR扩增仪进行扩增。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。应用2-△△Ct法计算miRNA-335的mRNA相对表达量。

1.4 CCK-8检测细胞增殖

人肺癌A549细胞以1×104/ml的浓度接种至96孔细胞培养板中，每孔加入100 μl，每孔设置3个复孔，培养箱中培养24 h后进行同步化处理，根据上述分组进行转染，取转染48 h的细胞，在每孔细胞中加入10 μl的CCK8溶液，培养箱内孵育2 h，利用全自动酶标仪检测570 nm波长的吸光度（absorbance，A）。计算细胞存活率。细胞存活率=（转染组细胞A值/对照组细胞A值）×100%。其中，每组实验重复3次。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

细胞分组同1.2，取转染48 h的细胞，加入预冷的磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤细胞，胰蛋白酶消化细胞，调整细胞浓度为1×106/ml，根据细胞凋亡试剂盒的操作说明检测各组细胞的凋亡情况。

1.6 蛋白质印迹法（Western blot）检测survivin蛋白表达

收集转染48 h的上述3组细胞，加入适量的细胞裂解液提取细胞中的蛋白，使用BCA试剂盒检测提取蛋白的浓度，蛋白样品与上样缓冲液按照1∶5的比例充分混匀后置于100℃孵育器内煮沸变性10 min，每泳道30 μg蛋白样品，10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离，半干法聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）转染，5%的脱脂奶粉封闭，加入一抗（survivin抗体按照1∶500稀释，GAPDH抗体按照1∶1000稀释），4℃过夜，洗膜后加入1∶5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，室温孵育1 h，洗膜后增强化学发光法（enhanced chemiluminecence，ECL）显色，X线片曝光，显影，定影。

1.7 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验，以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人肺癌A549细胞中miRNA-335的mRNA表达

对照组、空转染组及过表达组miRNA-335的mRNA 相对表达量分别为（1.00±0.18）、（1.09±0.16）、（7.79±0.59），3组比较，差异有统计学意义（F=335.501，P﹤0.05）。其中，空转染组与对照组miRNA-335的mRNA表达水平比较，差异无统计学意义（P﹥0.05）；过表达组miRNA-335的mRNA表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P﹤0.05）。（图1）

图1 3组细胞中miRNA-335的mRNA相对表达量

2.2 过表达miRNA-335对A549细胞增殖的影响

对照组、空转染组和过表达组的细胞存活率分别为（100.00±2.36）%、（96.56±3.46）%、（65.54±5.35）%，3组比较，差异有统计学意义（F=70.236，P﹤0.05）。其中，空转染组与对照组的细胞存活率比较，差异无统计学意义（P﹥0.05），而过表达组的细胞存活率低于对照组，差异有统计学意义（P﹤0.05）。（图2）

图2 过表达miRNA-335对A549细胞增殖的影响

2.3 过表达miRNA-335对A549细胞凋亡的影响

对照组、空转染组和过表达组的细胞凋亡率分别为（1.74±0.55）%、（1.78±0.58）%、（14.32±1.21）%，3组比较，差异有统计学意义（F=225.043，P﹤0.05）。其中，空转染组与对照组的细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（P﹥0.05），而过表达组的细胞凋亡率高于对照组，差异有统计学意义（P﹤0.05）。（图3）

图3 过表达miRNA-335对A549细胞凋亡的影响

2.4 miRNA-335过表达对survivin蛋白表达的影响

采用Western blot检测凋亡相关蛋白survivin的表达水平，结果显示，对照组、空转染组和过表达组survivin的蛋白表达量分别为（0.554±0.047）、（0.566±0.046）、（0.102±0.016），3组比较，差异有统计学意义（F=137.441，P﹤0.05）。空转染组与对照组的survivin蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P﹥0.05），而过表达组survivin的蛋白表达低于对照组，差异有统计学意义（P﹤0.05）。（图4）

3 讨论

图4 miRNA-335过表达对survivin蛋白表达水平的影响

目前，肿瘤的生物治疗成为肿瘤治疗的新思路，特别是利用基因治疗肿瘤。近些年，miRNA作为重要的生物体基因调控分子，其与肿瘤的关系已成为生物领域研究的热点。miRNA在结构及序列上进化保守，广泛存在于生物体内，可在转录后对一个或多个基因的表达进行调控，参与细胞的增殖、凋亡、分化及个体的生长发育等生命过程[8]。在多种肿瘤中，miRNA发挥抑癌基因或癌基因的作用，与肿瘤的发生发展、转移、复发等关系密切，如miRNA-378可参与非小细胞肺癌的脑转移，促进细胞的侵袭、迁移，进而促进肿瘤血管的形成[9]；miRNA-340在侵袭能力强的乳腺癌细胞中表达下调，诱导其表达可抑制肿瘤细胞的转移及侵袭[10]。

miRNA-335作为miRNA家族中的一员，近些年的研究发现，在不同肿瘤中，miRNA-335发挥不同的作用。研究显示，卵巢癌细胞中miRNA-335的表达水平降低或缺失，其表达与耐药呈负相关[11]；miRNA-335在胃癌细胞中可以通过靶向调控SP1的表达从而抑制肿瘤细胞的转移及侵袭[12]，而在星形胶质瘤细胞中miRNA-335呈高表达状态，其表达可增强肿瘤细胞的增殖及侵袭能力[13]。因此，miRNA-335在肺癌中的作用尚需进一步的研究。

有研究显示，miRNA-335在肺癌细胞中低表达[14]，本研究结果显示，过表达miRNA-335后，肺癌细胞的增殖受到抑制，凋亡数量增加。细胞凋亡在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的调控作用，其过程受到抗凋亡基因和促凋亡基因的共同调控。survivin是凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族中的一员，也是最强的凋亡抑制因子，可通过抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）的活性阻断凋亡的发生，从而在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要的作用[15]。研究显示，survivin在肺癌、胃癌等多种肿瘤细胞中呈现高表达，在肺癌细胞中抑制其表达可诱导肿瘤细胞的凋亡[16-17]。本研究中，过表达miRNA-335后检测肺癌细胞survivin的蛋白表达水平，结果显示，survivin蛋白的表达水平降低，说明过表达miRNA-335可以通过下调survivin诱导肺癌细胞的凋亡。

综上所述，上调肺癌细胞miRNA-335表达可以抑制肿瘤细胞的增殖，并通过下调survivin蛋白的表达诱导细胞凋亡。本研究从分子水平上为肺癌的发病原因寻找到了理想的标志物，也为肺癌的诊断与治疗提供了线索。

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