水蒸气蒸馏和超临界萃取来凤凤菊精油抗氧化研究

邢玉娟，陈新，刘梁，章慧，邱潍，周若兰

（武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

植物精油是植物体内的次生代谢物质，一般采用物理方法从芳香植物的花、草、叶、枝、皮、根、茎、果实、种子或分泌物中提取出来的具有一定香气和挥发性的油状物质[1]。目前提取植物精油的方法有水蒸气蒸馏法、溶剂提取法、压榨法、吸附法、超临界流体萃取法、微波辅助提取法、酶解辅助提取法、亚临界水提法等[2]。植物精油是一类天然植物性添加剂，能够矫正食品的异味，赋予香气，具有着色、抗菌消炎、防腐、抗氧化、抗肿瘤等作用[3]。因此，植物精油常被开发成天然防腐剂和杀菌剂，广泛应用在肉制品、果蔬制品、乳制品、水产品、焙烤制品等食品行业中[4]。

来凤凤菊又名神农香菊Dendranthelnaindicum（L.），产于湖北恩施来凤县，系菊科菊属（Dendranthema）的一个新变种植物，全株具有特殊的浓郁香气，具有疏风清热、平肝明目、散风降压等功效[5]。来凤凤菊作为菊科菊属新变种药材，其所含香气成分是天然香精香料的重要组成部分，提取的精油可以被广泛应用于食品加工、化妆品等行业。因其所含化学成分复杂，国内外学者对其化学成分及含量不断地进行深入研究，但是对来凤凤菊资源的开发应用等研究仍然需更加深入的探索[6]。本文采用水蒸气蒸馏法（steam distillation，SD）和超临界二氧化碳萃取法（supercriticalCO2fluid extraction，SFE）来提取来凤凤菊精油，通过5个抗氧化体系来比较这两种提取方法提取的来凤凤菊精油的抗氧化能力，为来凤凤菊资源的综合开发利用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

来凤凤菊：湖北来凤腾升香料公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）：凯玛生化有限公司；没食子酸丙酯（Propylgallatum，PG）：上海笛柏化学品技术有限公司；2，4，6-三吡啶基三嗪（2，4，6-Tri（2-pyridyl）-1，3，5-triazine，TPTZ）：上海源叶生物科技有限公司；2，2’-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）（2，2’-Azino-bis（3-ethylben zothiazoline-6-sulfonic acid） diammonium salt，ABTS）：Sigma公司；2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）：赛欧飞世尔科技有限公司；DMEM培养基：HyClone公司；磷酸氢二钠、乙酸钠：国药集团化学试剂有限公司；磷酸二氢钠、三氯乙酸、铁氰化钾：天津市博迪化工有限公司；氯化铁：天津市双船化学试剂厂；过硫酸钾：天津天力化学试剂有限公司；冰乙酸：天津永晟精细化工有限公司；无水乙醇：天津市富宇精细化工有限公司；其它所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

顶空气相色谱-质谱联用仪、Agilent HP-INNOWax毛细管色谱柱：安捷伦公司；HA221-50-06-C超临界CO2萃取仪：江苏南通华安超临界萃取有限公司；高速万能粉粹机：天津泰斯特仪器有限公司；Lambda25紫外分光光度计：美国珀金埃尔默公司；TGL-205台式高速冷冻离心机：长沙平凡仪器仪表有限公司；挥发油提取装置：武汉市江汉区泰信玻璃仪器；R-215旋转蒸发器：Buichi公司；SB25-12DT超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；精密电子天平：梅特勒-托利多公司；摩尔超纯水机：重庆摩尔水处理有限公司；数显恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BOXUN高压灭菌锅：广州沪瑞明仪器有限公司；ZHJH-1112B超净工作台：深圳朗普电子科技有限公司；GOLD-SIM二氧化碳培养箱：西盟国际集团金西盟（北京）有限公司；MDF-86V340医用低温保存箱：安徽中科都菱商用电器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 来凤凤菊挥发油的提取

1.3.1.1 水蒸气蒸馏法提取精油（SD精油）

精密称取来凤凤菊粉末200 g，置于2 000mL圆底烧瓶中，加入一定量的超纯水，再按《中华人民共和国药典》2010版Ⅰ部附录XD挥发油测定法的甲法操作，提取时间为5 h，待提取液冷却后，加入石油醚萃取3次，得到来凤凤菊挥发油提取液，浓缩，经无水硫酸钠干燥后，冷藏备用。

1.3.1.2 超临界二氧化碳提取精油（SFE精油）

精密称取来凤凤菊粗粉200g，装入萃取釜中，设定萃取釜工艺参数：分离罐Ⅰ为40℃，分离罐Ⅱ为25℃，压力为35MPa，温度为45℃，流量为20 L/h，萃取时间为2 h。从解析釜出料口出料得黄色黏稠液体，多次收集后冷藏备用。

1.3.2 DPPH自由基清除率的测定

参照沈科萍等的方法[7]，用无水乙醇分别配置浓度为 0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL 的 SFE 精油和SD精油，以人工合成抗氧化剂PG作为阳性对照。分别将2.0mL样品溶液和2.0mL浓度为0.1mmol/L DPPH溶液，混合均匀后暗处放置30min，以无水乙醇作为参比溶液，在517 nm处测定其吸光值A，同时测定2.0 mL样品溶液与2.0 mL无水乙醇混合后在517 nm处的吸光值A0，再测定2.0mLDPPH溶液和2.0mL无水乙醇混合液在517 nm处的吸光值A1，所有测定平行进行3次取平均值，按下式计算其清除率：DPPH 自由基清除率/%＝[1-（A-A0）/A1]×100。

1.3.3 ABTS+自由基清除率的测定

参考Xican Li等[8]方法，将等体积的7.4 mmol/L ABTS溶液与2.6mmol/L过硫酸钾溶液混合后置于暗处反应12 h～16 h。用无水乙醇将ABTS溶液稀释至在734 nm处吸光度为0.70±0.05。用无水乙醇分别配置浓度为 0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/mL 的 SFE 精油和SD精油，以抗氧化剂PG作为阳性对照。将0.2mL不同浓度样品加入2mLABTS+自由基溶液中，6min后测其吸光度A1。测定2mLABTS+自由基溶液与样品体积相同乙醇混合后的吸光度A0。所有测定平行进行3次取平均值，按下式计算其清除率：ABTS+自由基清除率/%=（A0-A1）/A0×100

1.3.4 总还原力的测定

参照YeChunlin等[9]方法，取2.5mL不同浓度（0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mg/mL）的样品溶液加入到装有2.5mL磷酸盐缓冲液（0.2mol/mL，pH=6.6）的具塞试管中，再加入2.5mL 1%K3Fe（CN）6溶液混合均匀，50℃恒温水浴反应20min，快速冷却后，加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液终止反应，10 000 r/min离心10min，取上清液 2.5mL，加入 2.5mL 水，0.5mL 0.1%三氯化铁溶液，混匀后静置10min，在700 nm下测吸光度，所有测定平行进行3次，取平均值。抗氧化剂PG作为阳性对照。

1.3.5 铁还原抗氧化能力（ferric reducing ability of plasma，FRAP 法）

参照 Katarzyna Szafrańska 等[10]方法，FRAP 工作液的配置：0.3 mol/L 醋酸缓冲溶（pH=3.6）、10 mmol/L 2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）盐酸溶液和20mmol/L FeCl3，溶液按10∶1∶1体积比配制，现用现配。分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mmol/L FeSO40.1mL，加入3.9mLFRAP工作液，37℃下水浴30min，以蒸馏水为参比，在593 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，得回归方程为y=0.308 45x+0.193 12（R2=0.998 75）。分别取 0.1mL 各供试品溶液（0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mg/mL），同法处理，测定吸光度。样品的抗氧化能力FRAP值以亚铁离子（相当于FeSO4）表示（mmol/L）。

1.3.6 清除细胞内活性氧的测定

参照苏海兰等[11]方法并稍作修改，取对数生长期的Hela细胞，调整细胞悬液浓度接种于96孔培养板中于37℃、5%CO2培养箱培养24 h。培养完成后将上清液吸除掉，用PBS清洗两遍，然后加入120μL不同浓度的 SFE 精油（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.25mg/mL）和SD精油（0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.5mg/mL），再加入 120 μL的10μmol/L的DCFH-DA溶液，混匀后立即用多功能读板器检测荧光强度，激发波长为485 nm，发射波长为538 nm，对照组用2.5mmol/L的双氧水代替样品，空白组用无水乙醇代替样品，所有样品均平行测定3次。

2 结果与讨论

2.1 清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517 nm处有最大吸收[12]。当有供氢能力的抗氧化剂存在时，供氢体被破坏，DPPH溶液的颜色变浅，吸光度值变小，因此可根据吸光度的变化测定抗氧化剂的活性[13]，见图1。

图1 不同浓度的SFE精油和SD精油对DPPH自由基的清除能力Fig.1 Scavenging capacity against DPPH radicalsof different concentrationsof SFE and SD essentialoil

如图1所示，两种方法提取的来凤凤菊精油都有一定清除DPPH自由基的能力，且清除率随着质量浓度的增加而增大。在相同浓度下，SFE精油清除DPPH自由基的能力要强于SD精油。但与阳性对照PG相比，SFE精油要远小于PG，0.2mg/mL的PG对DPPH自由基的清除率就达到90%以上。

2.2 ABTS+自由基清除率的测定

ABTS经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+，在734 nm处有最大吸收，当ABTS+溶液中加入自由基清除剂，则该物质会与ABTS+发生反应而使反应体系褪色，然后在ABTS+的最大吸光波长（734 nm）下检测吸光度变化，吸光度变化越大，抗氧化活性越大[14]，见图 2。

图2显示两种方法提取的凤菊精油对ABTS+自由基具有良好的清除能力，其清除能力随着精油质量浓度的升高逐渐增大，当浓度为2.0mg/mL时，SD精油可以清除29.45%的ABTS+自由基，SFE精油可以清除64.82%的ABTS+自由基，SFE精油比SD精油高了35.37%，但与阳性对照PG相比，来凤凤菊精油对ABTS+自由基的清除能力要弱于PG，而0.2mg/mL的PG对ABTS+自由基的清除率就达到了100%。

图2 不同浓度的SFE精油和SD精油对ABTS+自由基的清除能力Fig.2 Scavenging capacity againstABTS+radicalsofdifferent concentrationsof SFE and SD essentialoil

2.3 总还原力

利用普鲁士蓝法测定来凤凤菊精油的还原能力，以普鲁士蓝Fe4[Fe（CN）6]3的生成量作为指标，将[K3Fe（CN）6]还原成[K4Fe（CN）6]，再利用 Fe3+形成普鲁士蓝，并且在700 nm处有较大吸光峰，因此，可通过显色反应来判断还原程度，吸光度越大，表示其还原能力越强，抗氧化能力也越强[15]，见图3。

图3 不同浓度的SFE精油和SD精油的总还原能力Fig.3 The total reductive power of different concentrationsof SFE and SD essentialoil

由图3可以看出，当浓度为0.2mg/mL时，PG的还原力就达到最大值，两种方法提取凤菊精油的还原力虽然随着质量浓度的增大而增大，但其还原力要远低于阳性对照PG。在相同浓度下，SFE精油的还原力要大于SD精油。

2.4 总抗氧化能力的测定（FRAP法）

FRAP法是在酸性pH的环境中，Fe3+-TPTZ复合物与抗氧化剂反应形成Fe2+-TPTZ复合物使得在波长593 nm处的吸光度值有显著的变化[16]，该操作简单，且稳定性好，可以作为测定待测物质总抗氧化能力的一种方法。硫酸亚铁的标准曲线见图4，不同浓度的SFE精油和SD精油的总抗氧化能力见图5。

图4 硫酸亚铁的标准曲线Fig.4 Standard curveof ferroussulfate

图5 不同浓度的SFE精油和SD精油的总抗氧化能力Fig.5 Totalantioxidant capacity of different concentrationsof SFE and SD essentialoil

由图5可知，两种精油的总抗氧化能力呈明显的量效关系，随着样品质量浓度的增大，其总抗氧化能力不断增强。与阳性对照PG相比，SFE精油的总抗氧化能力要远低于PG，当浓度为0.5mg/mL时，PG的总抗氧化能力达到最大值。但在相同浓度下，SFE精油的总抗氧化能力要强于SD精油。

2.5 清除细胞内活性氧能力

DCFH-DA作为一种氧化指示剂，当其被细胞吸收并被细胞酯酶去脂化生成2’，7’-二氯荧光素二乙酸酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein，DCFH）后，细胞中的活性氧（reactive oxygen species，ROS）能将其氧化成带有荧光的二氯荧光黄（dichlorofluorescein，DCF），通过酶标仪进行荧光值测定，以荧光强度来指示细胞内ROS的水平[17-18]。不同浓度的SFE精油清除细胞内活性氧能力见图6，不同浓度的SD精油清除细胞内活性氧的能力见图7。

图6 不同浓度的SFE精油清除细胞内活性氧能力Fig.6 Theability to remove reactiveoxygen speciesof different concentrationsof SFE essentialoil in Hela cells

图7 不同浓度的SD精油清除细胞内活性氧的能力Fig.7 Theability to remove reactiveoxygen speciesof different concentrationsof SD essentialoil in Hela cells

由图6、图7可知，两种方法提取的来凤凤菊精油都具有清除细胞内自由基的作用，且随着样品质量浓度的升高，清除的自由基越多，需要的时间也就越短。在相同试验条件下，0.2mg/mL的SFE精油清除Hela细胞内活性氧的能力是0.4mg/mL的SD精油的1.6倍。因此，超临界提取的来凤凤菊精油对Hela细胞内自由基具有很强的清除作用。

3 结论

采用了5种不同的评价体系对两种来凤凤菊精油的抗氧化活性进行了研究，试验结果表明，SFE精油具有良好的抗氧化活性。但由于各种评价方法的机理有所差异，同一物质在不同评价体系里可能表现出不同的抗氧化活性，因此在筛选抗氧化剂时用多种方法进行综合评价是很有必要的[19]。

与水蒸气蒸馏法相比，超临界CO2萃取法作为一种新型萃取技术，操作温度低，且无溶剂残留，能较完好地保持来凤凤菊中有效成分不被破坏，避免不稳定化合物的降解，从而提高其抗氧化活性[20]。因此，用超临界CO2萃取法提取的来凤凤菊精油的抗氧化能力要大于水蒸气蒸馏法提取的精油。

目前，由于人们生活水平的提高，对绿色天然保健食品的要求越来越高，因此，超临界CO2萃取法提取的来凤凤菊精油作为一种新型绿色天然抗氧剂应用于食品行业具有一定的开发潜力。

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