姜黄挥发油联合顺铂对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖和凋亡的影响及机制

昝雪娟 荣冬芸 潘军玲 吕琳娜 肖露 曹煜

550000贵阳，贵州医科大学（昝雪娟、荣冬芸、潘军玲、吕琳娜、肖露）；贵州医科大学附属医院皮肤性病科（曹煜）

顺铂（diamine dichloro platinum）是临床上广泛应用的化疗药物，单用或者联合其他药物可用于多种肿瘤的治疗，但顺铂的剂量依赖性不良反应和耐药性是有效化疗的主要障碍之一。大量研究表明，联合化疗，特别是传统化疗药联合中药，对增加抗癌疗效和减轻单药不良反应具有很大应用价值［1⁃3］。姜黄挥发油（turmeric volatile oil，TVO）为姜科姜黄属植物姜黄（Curcuma longa L.）的主要提取物，具有抗炎、抗菌、祛痰、止咳、平喘等作用。TVO能有效抑制人皮肤鳞状细胞癌（简称鳞癌）A431细胞增殖，并诱导其凋亡［4］。我们将TVO与顺铂联合作用于体外培养的人皮肤鳞癌A431细胞，观察其对A431细胞的抑制作用，探讨其相互作用及抑癌机制，为TVO药物开发及临床应用提供理论和实验依据。

材料与方法

一、材料

TVO［贵阳舒美达药厂，批号：Z20025149，纯度80%，规格25 g，将其与二甲基亚砜（DMSO）以100∶1的比例混合，用培养基稀释成1 g/L，滤过除菌，4℃冰箱保存备用］，注射用顺铂（齐鲁制药有限公司，批号6M025A89，国药准字H37021358，规格：10 mg），用DMEM高糖完全培养基将其稀释为1 g/L，4℃冰箱避光保存备用，A431细胞、CCK8试剂盒、DMEM高糖培养基、吖啶橙（AO）/溴化乙锭（EB）双染细胞凋亡检测试剂盒（贵阳凯信生物工程有限公司），胎牛血清（杭州四季青有限公司），半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）⁃3、Caspase⁃9酶活性检测试剂盒（南京建成生物工程研究院），ELX800酶联免疫检测仪（美国Biotech公司），兔抗人P糖蛋白单克隆抗体（美国Abcam公司），BD FACS Verse流式细胞仪（美国BD Biosciences公司）。

二、方法

1.细胞培养：用含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM完全培养基在37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养A431细胞，每2～3天更换1次培养基，待细胞铺满瓶底后，以0.25%胰蛋白酶消化，取对数生长期细胞用于实验。

2.CCK8法检测细胞增殖：

（1）不同浓度TVO对A431细胞增殖的影响：取对数生长期A431细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液（1×104/ml），接种于96孔板，每孔加100 μl细胞悬液，待细胞贴壁后，加入TVO，使终质量浓度分别为5、10、20、40、80 mg/L；对照组加入含有1%DMSO的DMEM高糖培养基，每个浓度设4个复孔，CO2培养箱中继续培养24 h，每孔加入10 μl CCK8试剂，孵育3 h，酶标仪检测吸光度值（A450），细胞生长抑制率（%）=（对照组A450-实验组A450）/（对照组A450-空白组A450）×100%。采用Calacusyn软件计算抑制细胞增殖50%的药物浓度（IC50）。

（2）TVO与顺铂单独或联用对A431细胞增殖的影响：取对数生长期A431细胞，按上述方法接种于96孔板，设对照组、TVO组、顺铂组及TVO+顺铂组。TVO组用40 mg/L TVO［根据“二、2（1）”实验结果选择，对A431细胞作用最明显且在IC50以下］处理，顺铂组用10 mg/L顺铂处理［5］，TVO+ 顺铂组用40 mg/L TVO和10 mg/L顺铂处理，对照组用含有1%DMSO的DMEM高糖培养基处理。继续培养24 h后，按上述方法测定细胞生长抑制率。计算联合指数（CI），CI=Eab/（Ea+Eb-Ea×Eb），Ea、Eb分别为单药作用抑制率，Eab为TVO+顺铂组细胞的抑制率。CI＞ 1为协同，1为相加，＜ 1为拮抗［6］。

3.细胞形态学变化：用完全DMEM高糖培养基调整对数生长期A431细胞密度为1×106/ml，接种至6孔板，每孔2 ml，置于37℃、5%CO2培养箱中培养12 h后，按“二、2（2）”分组处理细胞，培养24 h后，倒置显微镜观察细胞形态。

4.AO/EB双染色荧光显微镜观察细胞凋亡：用完全DMEM高糖培养基调整对数生长期A431细胞密度为1×106/ml，接种到6孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养12 h后，按“二、2（2）”中分组处理细胞24 h后，吸弃培养液，加入AO/EB染液4℃避光染色15 min，吸弃染液，PBS洗涤，荧光显微镜观察、拍照。

5.Caspase⁃3、Caspase⁃9 酶活性检测：细胞培养及分组方法同“二、2（4）”，处理24 h后，离心收集细胞，加入50 μl裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解30 min，期间涡旋3～4次，12 000×g、4℃离心10～15 min，吸取上清液，按照试剂盒说明书操作，37℃孵育4 h，用酶标仪检测405 nm波长处A值。Caspase⁃9（或Caspase⁃3）酶活性 = 实验组A405/对照组A405。

6.Caspase⁃3、P糖蛋白表达检测：采用 Western印迹法。按“二、2（4）”中分组处理24 h。收集细胞，PBS洗2次，裂解细胞，提取细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量。将含有等量蛋白的细胞裂解液用5×上样缓冲液稀释，置于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜，室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h；加入一抗（1∶1 000）4℃过夜；加碱性磷酸酶标记的二抗（1∶500）37℃孵育1 h，显色液显色后扫描成像。以β肌动蛋白的表达量为对照，计算并比较Caspase⁃3及P糖蛋白的相对表达量。

三、统计学处理

采用SPSS19.0统计软件。计量数据以±s表示，同一时段不同浓度TVO组间比较采用单因素方差分析，联合用药组与单药组间比较采用双因素方差分析，组间两两比较采样LSD⁃t检验；细胞增殖抑制率与药物浓度间的关系采用直线相关分析方法。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、TVO对A431细胞增殖抑制率的影响

A431细胞经不同浓度TVO作用24 h后，5、10、20、40、80 mg/L TVO对A431细胞增殖抑制率分别是12.83% ±6.4%、16.27% ±11.4%、21.61% ±9.1%、33.11%±2.0%、46.00%±3.3%，与对照组（4.03%±1.4%）相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。随着TVO浓度增高，A431细胞增殖抑制率逐渐升高，且在一定浓度范围内呈剂量依赖关系（r=0.657，P＜0.05）。24 h时TVO的IC50为（61.66±1.03）mg/L。

二、TVO和顺铂对A431细胞增殖的影响

A431细胞经TVO或（和）顺铂作用24 h后，细胞增殖均受到不同程度抑制，TVO与顺铂联用组与TVO组、顺铂组相比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。40 mg/L TVO与10 mg/L顺铂联用后CI值为1.366。

三、TVO与顺铂对A431细胞形态的影响

TVO与顺铂单独或联合作用A431细胞24 h后，倒置显微镜观察显示，对照组A431细胞呈条索状或多角形，贴壁生长紧密，形态一致，均质性，较透亮，折光性强，细胞排列均匀；TVO组贴壁细胞数量减少，细胞形态欠规则，细胞间隙略增大，部分呈长梭形，部分细胞变圆，折光度下降；顺铂组贴壁细胞数量大量减少，形态不规则，部分细胞皱缩、变圆，细胞内颗粒增多；TVO+顺铂组细胞已无正常细胞形态，单位面积细胞数明显减少，出现小片状无细胞生长区，部分细胞裂解成细胞碎片，并有大量漂浮细胞。

图1 荧光显微镜下观察各组A431细胞凋亡（×200） 1A：对照组细胞核较大，核膜完整；1B：姜黄挥发油组可见少量细胞核染色质着黄色或橙黄色的早期凋亡细胞；1C：顺铂组可见大量黄色荧光和橘红色荧光；1D：姜黄挥发油+顺铂组细胞密度下降，可见橘红色坏死细胞及碎片

四、TVO与顺铂对细胞凋亡的影响

见图1。AO/EB双染色观察显示，TVO与顺铂单独或联合作用A431细胞24 h后，对照组细胞数目较多，且为活细胞，核染色质染成绿色，形状均匀；TVO组部分细胞核染色质染成黄色或橙黄色的早期凋亡细胞；顺铂组中可见细胞核染色质着橙黄色荧光的早期凋亡细胞和着橘红色荧光的晚期凋亡细胞；TVO+顺铂组细胞密度明显下降，可见大量细胞核染色质呈橘红色，并可见橘红色坏死细胞及碎片。

表1 姜黄挥发油（TVO）和顺铂单独或联合对A431细胞增殖和Caspase⁃3、9活性以及Caspase⁃3蛋白和P糖蛋白表达的影响（±s）

表1 姜黄挥发油（TVO）和顺铂单独或联合对A431细胞增殖和Caspase⁃3、9活性以及Caspase⁃3蛋白和P糖蛋白表达的影响（±s）

注：n=4；与对照组相比，aP＜0.05；与TVO组相比，bP ＜0.05；与顺铂组相比，cP ＜0.05

组别对照组TVO组顺铂组TVO+顺铂组增殖抑制率（%）0.8±0.3 3.9±1.3a 23.3±7.6a 36.2±9.3a b c Caspase⁃3活性0.028±0.012 1.117±0.095a 1.381±0.089a 1.520±0.115a b c Caspase⁃9活性0.056±0.001 1.259±0.059a 1.829±0.171a 2.760±0.297a b c Caspase⁃3蛋白0.339±0.011a 1.156±0.006a 1.296±0.021a 1.482±0.016a b c P糖蛋白1.522±0.002a 1.311±0.011a 1.169±0.012a 0.528±0.014a b c

五、TVO 与顺铂对 A431细 胞 Caspase⁃3、Caspase⁃9 活性的影响

TVO与顺铂单独或联合作用A431细胞24 h后，TVO组、顺铂组及TVO+顺铂组中A431细胞Caspase⁃3、Caspase⁃9 酶活性较对照组均增强，且TVO+顺铂组高于TVO组、顺铂组（均P＜0.01）。见表1。

六、TVO与顺铂对A431细胞Caspase⁃3、P糖蛋白表达的影响

见表1、图2。TVO+顺铂组P糖蛋白表达量明显低于TVO组、顺铂组，TVO+顺铂组Caspase⁃3表达量均明显高于TVO组、顺铂组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

图2 不同浓度姜黄挥发油（TVO）对A431细胞中P糖蛋白、Caspase⁃3蛋白表达的影响

讨 论

顺铂是一种金属铂类化合物，可结合癌细胞DNA，干扰其复制，达到破坏DNA结构和功能的效果。顺铂被公认为是治疗多种肿瘤（包括皮肤鳞癌）的一线用药，但因其毒性大、易耐药，在临床上多以铂类药物为基础制定联合治疗方案［7⁃9］。因此寻找能够增敏顺铂且减轻其毒性和不良反应的新型药物有重要临床意义。肿瘤细胞耐药性的产生是一个多因素参与的复杂过程，其中P糖蛋白的过度表达是引起多药耐药（MDR）的主要机制［10⁃11］。P糖蛋白由多药耐药基因mdr1编码，是一种相对分子质量为170 000的跨膜糖蛋白（P170），位于细胞膜上，作为识别蛋白不停地筛查外来疏水分子，这些分子包括许多有害物质，也包括一些很重要的物质，如顺铂、环孢素等其他抗癌药，它具有能量依赖性“药泵”功能，可使细胞内药物泵出细胞外，降低细胞内药物浓度使细胞产生耐药性。此外，P糖蛋白还可使细胞内药物再分布从而进一步减少靶点部位药物浓度［12］。P糖蛋白在肿瘤细胞耐药株中的表达水平较普通细胞株显著上调［13⁃14］，可使肿瘤细胞抗凋亡能力增强。近年有研究表明，P糖蛋白可能通过一些信号通路参与肿瘤MDR发生［15⁃16］，如抑制Fas系统，激活Caspase⁃8活性［17］，同时抑制线粒体膜电位下降［18］。此外，P糖蛋白还可直接进行凋亡抑制，延迟凋亡级联反应，抑制Caspase⁃3激活，进而抑制Caspase依赖型凋亡［19］。还有研究显示，活化的Caspase⁃3能通过分解DNA蛋白激酶来更加显著地抑制DNA⁃PKcs/Akt/GSK⁃3β信号通路，从而降低P糖蛋白的表达［20］。

本研究结果显示，随着浓度增加，TVO对细胞增殖的抑制作用增强，呈一定程度剂量依赖关系，进一步证实TVO能有效抑制人皮肤鳞癌A431细胞增殖［4］；同时，TVO与顺铂联用对A431细胞的增殖抑制作用强于TVO或顺铂单用，两药具有明显的协同作用。而且，TVO+顺铂组凋亡、死亡细胞明显增加，多无正常细胞形态，Caspase⁃3和Caspase⁃9活性升高，由于Caspase⁃9是线粒体通路凋亡的关键蛋白酶，提示线粒体通路参与凋亡过程。TVO+顺铂组P糖蛋白表达明显降低，而Caspase⁃3蛋白表达明显增加，提示TVO可能通过降低P糖蛋白的表达或影响其功能，同时诱导Caspase⁃3激活，抑制A431细胞对顺铂产生MDR，促进顺铂诱发肿瘤细胞凋亡。

总之，TVO不仅自身可抑制A431细胞增殖，与顺铂可以发挥协同抗A431细胞作用，其可能是通过线粒体介导的内源性途径发挥作用，与活化Caspase系统及降低P糖蛋白表达相关，但确切的分子机制尚待进一步探讨。

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