Skp2、p27和Ki-67在乳腺癌中的表达及意义

刘庆猛 李美平 吴满武 石 丹 谭卫峰

1.绍兴第二医院病理科，浙江绍兴 312000；2.绍兴市妇幼保健院病理科，浙江绍兴 312000；3.绍兴市妇幼保健院遗传室，浙江绍兴 312000

泛素-蛋白酶体途径（Ubiqutin-proteasome pathway）是细胞周期调控的重要途径之一，其作用机制通过信号传导通路控制、蛋白酶活性调节等方式，调控某些癌基因和抑癌基因的活性，调节细胞周期转录因子的表达，从而影响细胞周期进程，参与肿瘤的发生和发展过程[1]。p27作为一种细胞周期蛋白激酶抑制剂，通过竞争性结合Cyclin-CDK复合物的受体位点，抑制Cyclin-CDK复合物的活性，参与细胞周期调控过程，被认为是一种抑癌基因，在乳腺癌中p27呈低表达,与乳腺癌侵袭、转移有关，p27失表达提示预后不良[2,3]。S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein 2，Skp2）可通过泛素-蛋白酶体途径，降解多种参与细胞周期调控因子，Skp2过度表达时，通过磷酸化降解p27功能区，使其失去细胞周期调控功能，细胞过度增殖，导致肿瘤的发生[4,5]。Ki-67增殖指数高低与许多肿瘤预后密切相关，在乳腺癌分子分型和个体化治疗方案制定中具有重要意义，Ki-67指数可作为肿瘤复发和预后评估有价值的免疫标记[6]。Skp2、p27表达异常与多种肿瘤的发生有关，Ki-67指数在肿瘤的分级、分子分型与预后判断中越来越受到重视，有关Ki-67指数与Skp2、p27表达异常的关系在乳腺癌中的研究国内罕见报道，我们采用组织芯片技术和免疫组织化学方法检测乳腺癌中Skp2、p27和Ki-67的表达情况，探讨三者在乳腺癌中表达的意义及相互关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年3月～2016年10月期间我院收治的80例乳腺癌病例，均为女性患者，年龄32～78岁，平均（52.18±11.79）岁。所有患者术前均未进行化疗和放疗。病理组织学类型：浸润性癌68例，原位癌12例，其中浸润性导管癌，非特殊型42例，浸润性小叶癌12例，特殊类型浸润性癌14例（黏液癌7例，小管癌4例，实性乳头状癌3例），导管原位癌8例，小叶原位癌4例。腋窝淋巴结状态：阳性43例，阴性37例。所有标本均经过10%中性福尔马林充分固定，固定时间24～36 h，石蜡包埋。

1.2 方法

1.2.1 待测80例乳腺癌组织芯片蜡块的制备[7]第一步：组织芯片空白蜡块制作：组织芯片仪制作10×8点阵的蜡模，大小约 3.0 cm×2.0 cm，厚度约0.6 cm，预热后用打孔仪打孔，即制成含80个点阵空白蜡块。第二步：组织芯片蜡块制作过程：先将研究样本蜡块放入50℃恒温箱中烘烤15 min左右预热，再将蜡块对应的HE切片于显微镜下观察，选定肿瘤组织位置后，蜡块上进行定位标记，空心穿刺针钻取目标肿瘤组织区域，逐一转移至空白蜡块相应的孔位内填实并压紧，待全部芯片位点组织填满后，最后对含乳腺癌组织芯片的蜡块进行二次包埋，待自然冷却，再放入60℃恒温箱内烘烤30 min后取出，即完成80例乳腺癌组织芯片蜡块的制备。

1.2.2 采用组织芯片免疫组化检测Skp2、p27和Ki-67蛋白的表达 本实验所需免疫组化检测试剂及试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司，免疫组化染色仪为赛墨飞Labvision Autostainer 480s，采用MaxvisionTM3二步法进行免疫组化染色。乳腺癌组织芯片蜡块4～5 μm厚切白片，裱于防脱粘附载玻片，经过常规烤片、脱蜡、水化，EDTA抗原修复，染色过程由免疫组化染色仪完成，DAB显色，根据镜下观察染色效果控制显色时间，苏木素复染，脱水、透明、封片。以已知阳性组织作实验阳性外对照，以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，同时以手工染色作为免疫组化仪对照组，每个免疫组化酶标应用两张芯片标记，两份芯片检测实验结果比对。

1.3 结果判断

染色阳性信号呈棕黄色颗粒，阳性定位于细胞核为主。根据组织芯片排列的点阵，按顺序记录每一个芯片位点的免疫组化染色结果，逐一计算每个组织芯片位点中乳腺癌肿瘤细胞阳性细胞数占比。以阳性对照组织免疫组化染色阳性结果可靠作为有效判读前提，Skp2和p27的判读标准：肿瘤阳性细胞数＜1%为阴性（－）；≥1%肿瘤阳性细胞数且<25%者为阳性（+）；肿瘤阳性细胞数≥25%者为强阳性（++）[8]。Ki-67的判读标准：肿瘤阳性细胞数<14%者为低表达组（low）；肿瘤阳性细胞数≥14%者为高表达组（high）[9]。

1.4 统计学方法

实验数据应用SPSS13.0统计软件分析，Skp2、p27、Ki-67表达的计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义，三者相关性采用Spearman相关检验，相关系数以r表示。

2 结果

2.1 乳腺癌组织芯片免疫组化检测结果

Skp2、p27和Ki-67免疫组化染色阳性定位于细胞核，呈棕黄色颗粒，如封三图3～5所示，光镜下观察，免疫组化染色×200倍。

2.2 不同组织学类型乳腺癌中Skp2、p27和Ki-67的表达

80例不同组织学类型乳腺癌中Skp2、p27和Ki-67的表达情况见表1，实验结果显示乳腺浸润性癌中Skp2表达显著高于原位癌，差异具有统计学意义（χ2=5.83，P<0.05），浸润性癌中 p27表达低于原位癌（χ2=7.86，P<0.01），浸润性癌中Ki-67表达显著高于原位癌（χ2=9.17，P<0.01）。 但 Skp2、p27 和 Ki-67 的表达在浸润性乳腺癌不同组织学类型中差异均无显著统计学意义（P>0.05）。直线回归相关性检验结果表明，乳腺癌的侵袭浸润与Skp2表达增高正相关（r=0.29），与p27失表达负相关（r=-0.31），与Ki-67表达增高正相关（r=0.34）。

2.3 不同腋窝淋巴结转移状态Skp2、p27和Ki-67的表达

乳腺癌不同腋窝淋巴结转移状态中Skp2、p27和Ki-67的表达见表2，实验结果发现腋窝淋巴结阳性组Skp2表达显著高于阴性组，差异具有统计学意义（χ2=28.56，P<0.01），腋窝淋巴结阳性组 p27 表达低于阴性组（χ2=22.18，P<0.01），腋窝淋巴结阳性组 Ki-67高表达率显著高于阴性组（χ2=33.47，P<0.01）。直线回归相关性检验显示，乳腺癌的腋窝淋巴结转移与Skp2表达增高正相关（r=0.58），与p27失表达负相关（r=-0.53），与 Ki-67 表达增高正相关（r=0.68）。

2.4 Skp2、p27和Ki-67三者表达之间的相关性

乳腺癌中Skp2、p27和Ki-67三者表达之间的相关性见表3和表4，数据显示Skp2在p27阳性乳腺癌中阳性率为19.4%，而在p27阴性乳腺癌中阳性率为68.2%，差异具有显著统计学意义 (χ2=20.79，P<0.01)。Ki-67在p27阳性乳腺癌中检测到高表达7例，低表达29例，而在p27阴性乳腺癌中检测到高表达38例，低表达6例，二者具有显著性差异 （χ2=34.86，P<0.01）。Ki-67在Skp2阳性乳腺癌中检测到高表达29例，低表达8例，而在Skp2阴性乳腺癌中检测到高表达16例，低表达27例，二者具有显著性差异（χ2=16.80，P<0.01）。直线回归相关性检验结果显示乳腺癌中Skp2的高表达与p27的失表达呈负相关性（r=-0.56），p27失表达与Ki-67的高表达呈负相关性（r=-0.63）。Skp2与Ki-67的表达之间呈正相关性（r=0.48）。

表3 乳腺癌中p27、Skp2和Ki-67表达的相关性

表4 乳腺癌中Skp2与Ki-67表达的相关性

3 讨论

S期激酶相关蛋白-2（Skp2）是DNA复制所必需的人类F-box蛋白家族中的一员。Skp2参与正常细胞增殖调节，另外，Skp2还参与转录调控。Skp2通过泛素蛋白酶水解转录因子而发挥作用，并可促进cmyc诱导的S期转变和活化c-myc的靶基因。研究表明，Skp2在乳腺癌中表达增高，提示Skp2的异常表达与乳腺癌的发生关系密切[10-12]。p27作为一个细胞周期负性调控因子，通过两条途径发挥作用：抑制CDK激活及激活后的Cyclin-CDK复合物的活性。另外，p27可增强细胞间的粘附，还可诱导、促进细胞凋亡。研究发现，当Skp2过度表达时，p27被过度磷酸化降解，p27失活后丧失其细胞周期调控作用，细胞增殖无限制进行，导致肿瘤的发生。因此，Skp2、p27Kip1异常表达与乳腺癌的发生密切相关[13-15]。本组实验显示Skp2在乳腺浸润性癌中的表达显著高于原位癌，提示Skp2的表达与乳腺癌的浸润侵袭有一定关系。腋窝淋巴结阳性组显著高于阴性组，实验结果表明Skp2的高表达还与乳腺癌腋窝淋巴结转移密切相关。

p27蛋白缺失或低表达在恶性肿瘤中是一个较为普遍的现象，且低表达预示不良结局。p27通过竞争性结合Cyclin-CDK复合物的受体位点，抑制Cyclin-CDK复合物的活性，参与细胞周期调控过程，p27水平的下降会加速细胞周期G1期的进展，促进细胞不断增殖，p27除通过影响细胞增殖和凋亡在肿瘤的发生、发展中起重要作用外，还参与了细胞分化过程，因此它的水平高低与肿瘤的恶性程度有关，研究报道p27水平越低预示着肿瘤预后越差[16,17]。本组实验结果表明，p27在浸润性乳腺癌中显著低于原位癌，且与Skp2高表达有相关性，二者共同参与乳腺癌的浸润进展过程。腋窝淋巴结阳性组中p27的表达显著低于阴性组，提示p27的低表达与乳腺癌腋窝淋巴结转移有关。

表1 不同组织学类型乳腺癌中Skp2、p27和Ki-67的表达

表2 乳腺癌不同腋窝淋巴结转移状态Skp2、p27和Ki-67的表达

Ki-67增殖指数高低与许多肿瘤预后密切相关，在乳腺癌分子分型中Ki-67指数意义重大，2011版专家共识将Ki-67指数14%作为临界值进行Luminal A和Luminal B型区分的重要依据[9]。Ki-67指数在多种肿瘤的分级分期和预后评估中具有重要意义，大量研究结果表明，Ki-67指数可作为乳腺癌预后和疗效评估有价值的免疫标记[18-27]。本组实验结果显示，Ki-67在浸润性乳腺癌中的表达显著高于原位癌，腋窝淋巴结阳性组的表达显著高于阴性组，表明Ki-67的高表达率与乳腺癌的浸润进展程度和淋巴结转移密切相关。本组实验结果显示Skp2与Ki-67的表达之间呈正相关，p27与Ki-67的表达之间呈负相关。提示在乳腺癌细胞增殖调控机制中，p27具有阻止细胞周期进程的作用，从而抑制细胞增殖，而Skp2发挥着降解细胞周期调控因子p27，促进细胞增殖的作用。

本研究还发现，Skp2、p27和Ki-67在乳腺浸润性癌不同组织学类型中表达虽然存在一定差异，但差异均无统计学意义（P＞0.05），分析其原因，可能与特殊类型浸润性癌的样本数太少有关，还有待于大样本研究证实。1998年Kononen等[22]成功构建组织芯片技术后，组织芯片以其高通量、高效性和低成本的技术优势得到广泛应用，特别在大样本的研究中具有显著优势。笔者应用组织芯片技术进行免疫组化检测积累丰富的经验，并成功地运用组织芯片进行荧光原位杂交（FISH）检测，实验结果与传统切片检测相符合[7]。本研究采用组织芯片对80例乳腺组织进行免疫组化检测，每个免疫酶标各备用一张芯片，仅用六张芯片组织即完成全部检测需要，极大地降低研究成本，同一免疫酶标两张芯片的检测结果还可以相互比对，实验结果更客观、可靠，应用组织芯片进行大样本的免疫组化研究具有高效、经济的优势。

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