SIRT1对肺炎链球菌感染肺上皮细胞诱导LL-37表达的调控机制

应 樱

浙江省嘉兴市第一医院呼吸科，浙江嘉兴 314000

目前，抗生素耐药已经成为一个重大的公共卫生问题，临床治疗感染性疾病的新方向变为将内源性天然抗生素抗菌肽LL-37表达增加，促进宿主免疫防御功能的提升[1-3]。为了将有效的理论依据提供给临床对抗生素的科学合理应用，对感染性疾病进行积极有效的治疗，从而对患者预后进行切实有效的改善，本文研究SIRT1对肺炎链球菌感染肺上皮细胞诱导LL-37表达的调控机制进行了研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

实验设计时间为2016年11月～2017年10月，采用中国科学院上海细胞生物研究所细胞库提供的人肺腺癌细胞系A549（A549细胞）、人支气管上皮细胞（BEAS-2B细胞），美国模式肺炎链球菌（SP）作为细胞菌株，培养物集存库 （ATCC）为6303。美国GIBCO公司生产的RPMI1640培养基、杭州四季青生物工程材料有限公司生产的胎牛血清、美国OXOID公司生产的哥伦比亚血琼脂基础等，美国Forma公司生产的二级生物安全柜，美国Thermo公司生产的超净工作台、CO2培养箱等。

1.2 方法

对细胞进行重悬，在此过程中将不含双抗RPMI1640培养液充分利用起来，以（3～4）×105/mL密度在6孔板中接种A549细胞，待细胞向30%～50%满皿底面积生长时分为对照组、si-SIRT1序列①组、si-SIRT1序列②组、阴性对照 siRNA（siRNA-NC）组、lipo组五组。其中对照组不将其他试剂加入培养基；si-SIRT1序列①组将转染si-SIRT1序列①加入培养基；si-SIRT1序列②组将转染si-SIRT1序列②加入培养基；阴性对照siRNA（siRNA-NC）组将转染不匹配人的任何基因的siRNA（转染无意义siRNA）加入培养基，将其作为对照，以将本实验受到siRNA及转染操作的影响排除；lipo组将lipofectaminTM2000试剂加入培养基，以将本实验受到脂质体的影响排除。上海吉马公司设计合成SIRT1 siRNA序列，具体见表1。由于细胞转染siRNA中涉及RNA，因此去酶处理实验中应用EP管及枪头等实验器材，从而有效避免Rnase降解的现象。采用qRT-PCR对A549细胞的SIRT1沉默效果进行检测，并采用Western Blot对A549细胞的SIRT1沉默效果进行检测[4-10]。

表1 SIRT1 siRNA序列[4]

1.3 观察指标

培养瓶或6孔板中的BEAS-2B及A549细胞向30%～50%左右满皿底面积生长时分别进行3 d的细胞转染处理，在此过程中严格依据组别，SIRT1激动剂（SRT1720）对细胞进行干预后，将新鲜无双抗培养液加入其中孵育。将MOI：20的SP菌悬液加入到各孔中，对照组除外，进行6 h的感染后将感染终止。将PBS预处理细胞设定为对照组，将SPS感染设定为SP组，将SP感染+75 nmol/L si-SIRT1序列②转染3 d设定为si-SIRT1+SP组，将SP感染+25 μmol/L的SRT1720预赋予1 d设定为SRT1720+SP组，将SP感染+25 μmol/L DMSO预孵育 1 d设定为 DMSO+SP组，各组均进行3次重复。采用LDH细胞毒性试验对各组细胞活力进行检测，采用qRT-PCR对BEAS-2B及A549细胞SIRT1及LL-37 mRNA表达进行检测，采用ELISA对BEAS-2B及A549细胞上清液LL-37浓度进行检测[11-18]。

1.4 统计学分析

采用SPSS21.0统计学软件，qRT-PCR检测A549细胞的SIRT1沉默效果、Western Blot检测A549细胞的SIRT1沉默效果、五组对BEAS-2B及A549细胞毒性活力的影响、SIRT1对 SP诱导 BEAS-2B及A549细胞表达LL-37 mRNA的影响等计量资料用（±s）表示，采用 t检验，检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 qRT-PCR检测A549细胞的SIRT1沉默效果

si-SIRT1序列①组、si-SIRT1序列②组的SIRT1 mRNA均显著低于对照组（P<0.05），而si-SIRT1序列②组的SIRT1 mRNA又显著低于si-SIRT1序列①组（P<0.05），见表 2。

表2 qRT-PCR检测A549细胞的SIRT1沉默效果（±s）

表2 qRT-PCR检测A549细胞的SIRT1沉默效果（±s）

注：与si-SIRT1序列①组比较，#P<0.05；与对照组比较，*P<0.05

组别 独立试验次数 SIRT1 mRNA对照组si-SIRT1序列①组si-SIRT1序列②组siRNA-NC组lipo组F值P 33333 1.05±0.11 0.70±0.12*0.15±0.04#*0.93±0.10 1.12±0.10 42.660<0.05

2.2 Western Blot检测A549细胞的SIRT1沉默效果

si-SIRT1序列①组、si-SIRT1序列②组的SIRT1/β-actin均显著低于对照组（P<0.05），lipo组的SIRT1/β-actin显著高于对照组（P<0.05），但 siRNA-NC组和对照组的SIRT1/β-actin之间的差异不显著 （P>0.05），si-SIRT1 序 列 ① 组 、si-SIRT1 序 列 ② 组 的SIRT1/β-actin 之间的差异也不显著（P>0.05），见表3。

2.3 五组对BEAS-2B及A549细胞毒性活力的影响比较

SP组、si-SIRT1+SP组的BEAS-2B及A549细胞毒性均显著高于对照组（P<0.05），而si-SIRT1+SP组的BEAS-2B及A549细胞毒性又均显著高于SP组（P<0.05），见表 4。

表3 Western Blot检测A549细胞的SIRT1沉默效果（±s）

表3 Western Blot检测A549细胞的SIRT1沉默效果（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05

组别 独立试验次数 SIRT1/β-actin对照组si-SIRT1序列①组si-SIRT1序列②组siRNA-NC组lipo组F值P 33333 0.23±0.01 0.14±0.01*0.11±0.01*0.20±0.01 0.40±0.03*72.530<0.05

表4 五组对BEAS-2B及A549细胞毒性活力的影响比较（±s，%）

表4 五组对BEAS-2B及A549细胞毒性活力的影响比较（±s，%）

注：与SP组比较，*P<0.05

组别 独立试验次数 BEAS-2B细胞毒性 A549细胞毒性对照组SP组si-SIRT1+SP组SRT1720+SP组DMSO+SP组F值P 33333 0.35±0.07*7.74±1.65 19.60±1.86*8.51±0.80 8.34±1.51 98.261<0.05 0.20±0.03*4.42±0.40 15.26±1.63*4.85±0.25 4.67±0.38 152.920<0.05

2.4 SIRT1对SP诱导BEAS-2B及A549细胞表达LL-37 mRNA的影响

2.4.1 SIRT1对SP诱导BEAS-2B细胞表达LL-37mRNA的影响 BEAS-2B细胞方面，si-SIRT1+SP组的SIRT1 mRNA 显著低于 SP 组（P<0.05），LL-37 mRNA显著高于SP组（P<0.05）；SRT1720+SP组的SIRT1 mRNA显著高于SP组（P<0.05），LL-37 mRNA显著低于SP 组（P<0.05）。 SP 组、SRT1720+SP 组、DMSO+SP 组的 SIRT1 mRNA均显著高于对照组 （P<0.05），si-SIRT1+SP组的SIRT1 mRNA显著低于对照组 （P<0.05）；SP 组、si-SIRT1+SP 组的 LL-37 mRNA均显著高于对照组 （P<0.05），SRT1720+SP组的LL-37 mRNA显著低于对照组（P<0.05），但DMSO+SP组和对照组的LL-37 mRNA之间的差异不显著（P>0.05），见表5。

表5 SIRT1对SP诱导BEAS-2B细胞表达LL-37mRNA的影响（±s）

表5 SIRT1对SP诱导BEAS-2B细胞表达LL-37mRNA的影响（±s）

注：与SP组比较，#P<0.05；与对照组比较，*P<0.05

组别 独立试验次数 SIRT1 mRNA LL-37 mRNA对照组SP组si-SIRT1+SP组SRT1720+SP组DMSO+SP组F值P 55555 1.04±0.11 3.05±0.42*0.20±0.05#*8.54±0.55#*2.95±0.32*420.445<0.05 1.07±0.17 3.88±0.35*12.78±2.32#*0.43±0.04#*2.87±0.54 105.930<0.05

2.4.2 SIRT1对SP诱导A549细胞表达LL-37 mR-

NA的影响 A549细胞方面，si-SIRT1+SP组的SIRT1mRNA显著低于SP组（P<0.05），LL-37 mRNA显著高于SP 组（P<0.05）；SRT1720+SP 组的SIRT1 mRNA 显著高于 SP组（P<0.05），LL-37 mRNA 显著低于 SP组（P<0.05）。SP组、SRT1720+SP组、DMSO+SP组的 SIRT1 mRNA均显著高于对照组 （P<0.05），si-SIRT1+SP组的 SIRT1 mRNA 显著低于对照组（P<0.05）；SP组、si-SIRT1+SP组的LL-37 mRNA均显著高于对照组 （P<0.05），SRT1720+SP组的LL-37 mRNA显著低于对照组（P<0.05），但DMSO+SP组和对照组的LL-37 mRNA之间差异不显著（P>0.05），见表6。

表6 SIRT1对SP诱导A549细胞表达LL-37 mRNA的影响（±s）

表6 SIRT1对SP诱导A549细胞表达LL-37 mRNA的影响（±s）

注：与SP组比较，#P<0.05；与对照组比较，*P<0.05

组别 独立试验次数 SIRT1 mRNA LL-37 mRNA对照组SP组si-SIRT1+SP组SRT1720+SP组DMSO+SP组F值P 55555 1.04±0.11 2.65±0.45*0.13±0.02#*5.54±0.44#*2.35±0.30*198.556<0.05 1.05±0.15 2.30±0.30*5.18±1.00#*0.47±0.08#*1.65±0.31 67.530<0.05

3 讨论

SIRT1的生物学作用广泛，能够对NAD+依赖性蛋白进行催化，促进其乙酰化的发生，在转录、代谢过程中作为调节因子发挥极为重要的作用[19-21]。LL-37受外源性微生物成分和内源性信号分子刺激诱导产生，其表达调控机制复杂多样，彼此存在交叉对话，且存在细胞种类和微环境刺激特异性。在细胞非应激状态时，l，25-二羟基维生素 D3[1，25-dihydroxyvitamin D3，l，25（OH）2D3]，在多种调控 LL-37 表达因子中起枢纽作用，多种物质可经维生素D3依赖机制放大其诱导效应。细胞因子可通过维生素D3介导或其他作用机制放大其诱导LL-37表达效应。在外界干扰触发内质网应激时，NF-κB．C/EBPa通路在表达调控中起关键作用。细胞分化状态亦参与LL-37的表达调控。最近应用无标记质谱定量分析的生物信息学软件又发现TR/RXR激活、类花生酸信号和类固醇生物合成这三种新型信号通路参与LL-37的表达调节。相关医学研究表明[22-25]，SP对BEAS-2B细胞活性造成损伤的方式为MOI与感染时间依赖性，SP感染BEAS-2B及A549细胞能够对LL-37表达进行诱导，在机体免疫防御反应中参与。与A549细胞相比，BEAS-2B细胞SP（MOI20）感染6 h及未感染状态下均具有显著较高的LL-37蛋白表达，以此认为LL-37表达可能具有细胞特异性。SP感染时，在BEAS-2B及A549细胞LL-37表达中，SIRT1均发挥着负性调节作用。

本研究结果表明，si-SIRT1序列①组、si-SIRT1序列②组的SIRT1 mRNA均显著低于对照组 （P<0.05），而si-SIRT1序列②组的SIRT1 mRNA又显著低于si-SIRT1序列①组 （P<0.05）；si-SIRT1序列①组、si-SIRT1序列②组的SIRT1/β-actin均显著低于对照组（P<0.05），lipo 组的 SIRT1/β-actin 显著高于对照组（P<0.05），但 siRNA-NC 组和对照组的 SIRT1/βactin之间的差异不显著 （P>0.05），si-SIRT1序列①组、si-SIRT1序列②组的SIRT1/β-actin之间的差异也不显著 （P>0.05）；SP组、si-SIRT1+SP组的 BEAS-2B及A549细胞毒性均显著高于对照组（P<0.05），而si-SIRT1+SP组的BEAS-2B及A549细胞毒性又均显著高于SP组 （P<0.05）；BEAS-2B细胞及A549细胞方面，si-SIRT1+SP组的SIRT1 mRNA显著低于SP组（P<0.05），LL-37 mRNA 显著高于 SP 组（P<0.05）；SRT1720+SP组的SIRT1 mRNA显著高于SP组 （P<0.05），LL-37 mRNA 显著低于 SP 组（P<0.05）。SP 组、SRT1720+SP组、DMSO+SP组的SIRT1 mRNA均显著高于对照组（P<0.05），si-SIRT1+SP组的SIRT1 mRNA显著低于对照组 （P<0.05）；SP组、si-SIRT1+SP组的LL-37 mRNA均显著高于对照组（P<0.05），SRT1720+SP组的LL-37 mRNA显著低于对照组 （P<0.05），但DMSO+SP组和对照组的LL-37 mRNA之间的差异不显著（P>0.05），和上述相关医学研究结果一致。

总之，SIRT1对肺炎链球菌感染肺上皮细胞诱导LL-37表达起负性调节作用，值得临床充分重视。

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