右美托咪定预给药对切口痛大鼠脊髓胶质细胞的影响

肖凡 罗振中 卢俊 陈受琳 黄丹 周斌 陈琴琴 华福洲

南昌大学第二附属医院麻醉科（南昌 330000）

胶质细胞激活对急性疼痛的产生和维持起关键作用。脊髓背角的胶质细胞被认为参与了疼痛反应［6］。脊髓的胶质细胞主要是小胶质细胞和星形胶质细胞。其在神经系统功能中都扮演着重要作用，参与免疫反应和炎症反应［7］。近年来脊髓胶质细胞在切口痛中的作用引起广泛关注，外周组织损伤、手术损伤、炎症和神经损伤等因素都可以激活脊髓胶质细胞。脊髓胶质细胞的激活不仅与术后机械痛敏的产生和维持有关，而且与异常性疼痛、痛觉过敏的产生和维持密切关系［1］。有研究表明抑制胶质细胞的激活可以阻断痛觉过敏状态。围术期使用麻醉镇痛药如氯胺酮及七氟醚等均可不同程度地抑制胶质细胞的激活［2］。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是高选择性α2⁃肾上腺素受体激动剂，研究证实具有镇痛作用［3］。然而右美托咪定对切口痛的影响及与胶质细胞的关系目前仍不清楚。本研究通过建立大鼠切口痛模型，观察右美托咪定对脊髓胶质细胞OX42、GFAP及炎性因子表达的影响，来探讨右美托咪定在切口痛中的作用，从而为减轻切口痛的发生和发展提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料右美托咪定（批号：H20100250，江苏恒瑞医药公司），小鼠抗大鼠OX42多克隆抗体（GBP公司，美国），兔抗大鼠GFAP多克隆抗体（UCL公司，美国），Real Eevision二抗检测系统（TECH公司，美国），von Frey纤维丝（Stolting公司，美国）。

1.2 实验分组清洁级健康成年雄性SD大鼠，体重200～220 g，取大鼠60只，随机分为4组（n=15）：S组为假手术组，O组为手术对照组，D1、D2组分别为低剂量及高剂量右美托咪定组。O组、D1组和D2组大鼠行左后足切开术制备切口痛模型，D1、D2组于术前10 min分别腹腔注射右美托咪定 30 μg/kg及 50 μg/kg［3］。S组和O组腹腔注射等量生理盐水。

1.3 大鼠切口痛模型的建立大鼠后爪趾部切口疼痛模型建立：参考BRENNAN［4］的方法，在吸入1.4%异氟醚麻醉（假手术组同等麻醉）平稳后，用碘伏消毒大鼠右后爪，在足趾面用11#刀片从距足跟0.5 cm处向足趾部作一长约1 cm的纵形切口（略微旁开正中线），依次切开皮肤和筋膜，用眼科镊挑起足底肌肉并纵向切割，但保持肌肉起止和附着的完整性，轻压止血后用5-0尼龙线缝合2针以缝合皮肤，切口局部涂抹抗生素软膏预防感染。手术结束后置入饲养笼，单独饲养，保持饲养环境一致：室温维持在20～25℃，正常昼夜节律，无强光和强噪声刺激，自由饮水和摄食。

1.4 术后行为学观察于建立后爪趾部切口疼痛模型的术前（T0）、术后2、6、12、24 h（T1-4）分别观察机械缩足反射阈值（MWT）。MWT测定：按CHAPLAN法［5］应用von Frey纤维丝测定大鼠右后足的机械缩足反射阈值。大鼠置于底部为金属丝网格的实验笼中，用一套应力不同并标有刻度的von Frey纤维丝垂直刺激大鼠右后足掌底部靠近切口的区域，维持纤维丝轻度弯曲4～6 s或在大鼠出现行为反应如缩足、逃避或舔足时停止刺激。从2.0 g的纤维丝开始，最大值为15.0 g，超过此值记为15.0 g，以up⁃down法推测阈值，在阈值上下各刺激5次，用内推算法算出50%反应阈值。每次刺激至少间隔15 s，并需等刺激引起的行为反应完全消失后再给予下一次刺激。

1.5 Western blot行为学实验结束后，各组取3只大鼠应用Western blot方法测定脊髓小胶质细胞标记物（OX42）和星形胶质细胞标记物（GFAP）的表达水平。在吸入1.4%异氟醚麻醉平稳后，将大鼠置于冰上，快速取出L4-6脊髓后放入2 mL冻存管中，再迅速存入液氮中。脊髓组织按照1 mL/100 mg比例加入裂解液，制成匀浆，离心取上清液，采用BSA法进行蛋白定量。取等量样品进行SDS⁃PAGE电泳，转移至PVDF膜，将膜分别与一抗室温下孵育，再与辣根过氧化物酶标记二抗室温下孵育，将膜与ECL发光底物接合，膜与胶片在暗室结合曝光、显影、成像。所得结果扫描后用进行定量分析，以目的蛋白灰度值与内参照β⁃actin灰度值的比值表示OX42和GFAP蛋白的表达。

1.6 脊髓IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃α含量的测定取出脊髓后，迅速冷冻、称重，加入预冷的含蛋白酶抑制剂的磷酸盐缓冲液手动匀浆，4℃下离心20 min后取上清液备用。采用ELISA法测定脊髓IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃α含量的测定。

1.7 统计学方法采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，组内及组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠不同时点MWT值比较四组大鼠T0时MWT值比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与S相比，O组大鼠T1-3时MWT值均下降（P＜0.05）；与O组相比，D1、D2组大鼠T1-3时MWT值均升高（P＜0.05）；与D1组相比，D2组大鼠T1-3时MWT值差异无统计学意义。见表1。

2.2 四组大鼠脊髓OX42及GFAP表达比较与S组相比，O组脊髓OX42表达上调（P＜0.05），脊髓GFAP表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与O组相比，D1、D2组脊髓OX42的表达表达下调（P＜0.05），脊髓GFAP表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

2.3 四组大鼠脊髓IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃α含量比较与S组相比，O组脊髓IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃α含量升高（P＜0.05）。与O组相比，D1、D2组脊髓IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃α含量下降（P＜ 0.05）。见表2。

表1 四组手术前后MWT比较Tab.1 Compaerson of MWT before and after operation of four groups（n=15） x ± s，g

图1 四组大鼠脊髓OX42及GFAP表达水平（n=6）Fig.1 Expression level of OX42 and GFAP in spinal cord for the four groups

表2 四组大鼠脊髓IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃α含量Tab.2 Levels of IL⁃1β，IL⁃6 and TNF⁃α in spinal cord for the four groups（n=3） x ± s，pg/mg

3 讨论

本实验采用的大鼠后爪趾部切口痛模型是经典的急性疼痛模型［4］。目前认为右美托咪定主要通过增加神经电刺激的阈值、减慢神经刺激的传播和减少动作电位的升高率来阻滞神经刺激的产生和传导。有研究［5］证实右美托咪定不仅可以阻断手术时疼痛的产生，而且可以较长时间影响机械痛敏，减少术中及术后阿片类药物用量。本研究行为学研究结果显示，腹腔注射右美托咪定可提高疼痛痛阈，减轻大鼠机械痛敏。

胶质细胞激活对急性疼痛的产生和维持起关键作用。脊髓背角的胶质细胞被认为参与了疼痛反应［6］。脊髓的胶质细胞主要是小胶质细胞和星形胶质细胞。其在神经系统功能中都扮演着重要作用，参与免疫反应和炎症反应［7］。近年来研究［8-9］表明，脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞与疼痛调制密切相关。OX42和GFAP分别是小胶质细胞和星形胶质细胞激活的特异性标志物［10］。在疼痛反应中，目前认为小胶质细胞往往首先被激活，活化的小胶质细胞再作用于相邻的星形胶质细胞，可导致慢性痛疼反应［11］。脊髓小胶质细胞的激活往往发生在疼痛发展的早期阶段，短暂且反复存在［12］；而星形胶质细胞的激活较晚且持久。本研究结果表明切口痛在大鼠脊髓背角OX42的表达上调，而GFAP却没有明显变化，这提示急性疼痛与脊髓小胶质细胞激活有关；但笔者未发现星形胶质细胞明显活化，可能与本实验选择的实验指标的检测时间有关。LIU等［13］研究也发现，在术后切口痛的后期中星形胶质细胞显著活化，可能与研究指标的检测时间在术后第3天相关。腹腔注射右美托咪定30 μg/kg及50 μg/kg均可抑制急性疼痛导致的小胶质细胞活化，但该剂量的变化无明显差异，提示我们的实验还有待改进。

脊髓小胶质细胞激活后，其释放大量的细胞因子、炎性介质和神经活性物质，如 IL⁃1、IL⁃6、TNF⁃α等，而这些物质又可反作用于脊髓小胶质细胞扩大疼痛反应，形成正反馈，导致炎症过度反应［14］。右美托咪定可通过抑制胶质细胞的炎性反应，干预中枢炎症［15］。本研究结果表明大鼠术后脊髓小胶质细胞IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃α含量明显提高，而右美托咪定预给药后可降低炎症因子的分泌，提示右美托咪定可以通过抑制脊髓小胶质细胞的激活而降低了IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃α的分泌。

综上所述，切口痛急性期脊髓小胶质细胞参与急性疼痛的发生发展；而右美托咪定可以通过抑制脊髓小胶质细胞激活而减轻急性疼痛状态。在急性痛模型中右美托咪定抑制脊髓胶质细胞的作用机制还有待进一步研究。

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