金黄色葡萄球菌肠毒素P双抗夹心酶联免疫检测方法的建立

杜玄，赵燕英，刘骥，龙虎，王洪志，田万帆，唐俊妮

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种重要的病原菌，极易污染食品并引发食物中毒，以及人或动物的组织感染、败血症和肺炎等[1,2]。在我国，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占所有细菌性食物中毒的比例高达20%～25%[3]。金黄色葡萄球菌引发的食物中毒主要是由肠毒素引起的。目前已发现的金黄色葡萄球菌肠毒素有 22种，根据其被发现的先后顺序，分别命名为传统肠毒素SEA～SEE和新型肠毒素SEG-SET，SElU，SElU2，SElV[4]。

对于新发现的肠毒素目前还缺乏检测方法。现有的检测金黄色葡萄球菌传统肠毒素和部分新型肠毒素的方法有分子生物学检测法、免疫学检测法和生物传感器法等[5]，其中，大多是针对毒素基因水平的检测，如Letertre等[6]利用实时荧光PCR（polymerase chain reaction）成功检测出了9种肠毒素基因，该检测技术快速，但只能检测核酸水平而不能检测蛋白本身。

酶联免疫吸附法（ELISA）是依靠抗原决定簇与抗体结合位点之间特异性进行检测，如 Rahimi等[7]用ELISA方法检测食品中的传统肠毒素SEA-SED；Nagaraj等[8]利用双抗夹心 ELISA（double-antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay，DAS-ELISA）的方法检测食品中的SEG；朱安妮等[9]利用双抗夹心 ELISA建立检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEI；Zhao等[10]利用双抗夹心ELISA检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM。但目前还未见检测新型肠毒素SEP的ELISA方法报道。

新型肠毒素 sep基因的核苷酸序列有 729 bp（NCBI登录号：YP_009113107.1），编码286个氨基酸残基的毒素蛋白SEP，分子量为27.89 ku。Hait等[11]在发生食物中毒事件的面包店中，检测出金黄色葡萄球菌新型肠毒素sep基因。Calderwood等[12]的研究发现携带sep基因的MRSA菌株会增加败血症的风险。因此，研究肠毒素SEP的夹心ELISA检测方法具有必要性，可为食品污染肠毒素SEP的风险识别提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SEP蛋白纯品（1.8 mg/mL），SEP单克隆抗体（2.3 mg/mL），抗SEP兔血清（1.57 mg/mL），以及SEK、SEI和SEM蛋白均为本实验室自制；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG（IgG/HRP）购自北京博奥森生物技术有限公司；四甲基联苯胺（TMB）底物溶液购自天根生化科技(北京)有限公司；Tween-20购自美国Amresco公司；脱脂奶粉购自英国Oxoid公司；96孔聚苯乙烯酶标板购自中国Costar公司；Elx-808型酶标仪购自美国Bio-Tek公司。

1.2 实验方法

1.2.1 SEP的DAS-ELISA工作流程

以适当稀释的SEP单克隆抗体包被酶标板，每孔100 μL，4 ℃包被过夜；倒出包被液，每孔加入含有Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST），清洗3次；随后，每孔加入200 μL的5%脱脂乳的磷酸盐缓冲液（PBS），37 ℃封闭1～2 h，洗板3次；再加入SEP纯品蛋白（20 μg/mL），每孔 100 μL，37 ℃孵育 45～90 min；加入抗SEP兔血清，100 μL/孔，37 ℃孵育 1 h；以羊抗兔IgG/HRP 为二抗，100 μL/孔，37 ℃孵育 30～60 min；洗板5次，加入TMB底物显色溶液，每孔100 μL，避光显色10～20 min；加入2 mol/L的硫酸溶液使反应停止。测定450 nm处的OD值，并计算P/N值（其中P为检测样品的OD450nm值；N为阴性对照OD450nm值）。

1.2.2 最佳抗体质量浓度确定

保持其余工作条件不变，采用1.2.1的流程分别对不同质量浓度下的抗SEP单克隆抗体（1.64、3.28、6.56 µg/mL）、不同稀释质量浓度的抗 SEP兔血清（1.57、3.14、6.28 µg/mL）和不同稀释度的IgG/HRP（稀释度为 1:3000、1:6000）进行检测。阳性孔用已知浓度的SEP蛋白纯品作对照，阴性孔用PBS代替抗原，反应结束，测定OD450nm值，并计算P/N值，根据P/N大小确定最佳抗SEP单克隆抗体和抗SEP兔血清浓度以及IgG/HRP最佳稀释度。

1.2.3 最佳检测条件确定

参照朱安妮[9]的方法，按照1.2.1的流程，在最佳抗体工作浓度的条件下，分别对不同种类的缓冲液（0.1 mol/L，pH 9.2碳酸盐）；1×PBS（pH 7.4）、封闭时长（1、1.5、2 h）、抗原孵育时间（45、60、90 min）、羊抗兔IgG/HRP反应时间（37 ℃：30、45、60 min）、TMB底物显色时间（10、15、20 min）进行 ELISA实验。检测阳性孔和阴性孔的OD450nm，计算并选择最大P/N值为最佳条件。

1.2.4 制备DAS-ELISA标准曲线

按照ELISA的工作程序，用夹心ELISA法检测不同质量浓度SEP抗原（0.63、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL），测定OD450nm值，并制作标准曲线。

1.2.5 灵敏度实验

利用DAS-ELISA法检测不同质量浓度的SEP蛋白（0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 μg/mL），测试 SEP检测方法的灵敏度。判断标准：P/N＞2.0为阳性。

1.2.6 精密度实验[9,13]

参考文献方法，批内变异将阳性对照组（20、10、5 μg/mL），阴性对照组分别作 5个孔，同时检测其OD450nm值；批间变异将上述标本连续5次检测OD450nm值。变异系数的计算公式为CV=(SD/¯x)×100%

1.2.7 DAS-ELISA方法的特异性分析

取实验室保存的 SEK、SEI和 SEM 纯品（10 μg/mL）作为样品检测。判断标准：P/N＞2.0为阳性结果。

1.2.8 测定人工污染样品中SEP回收率

SEP人工污染基质采用LB肉汤、牛肉糜和熟米饭。通过添加，使基质中SEP的含量分别为2.5、5、10和20 μg/mL。利用所建立的SEP的DAS-ELISA方法，分别测定样品和阴性对照的OD450nm，计算样品的回收率。

1.2.9 数据统计分析

每个检测样品做三次重复，数据采用 excel软件进行分析，实验结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 最佳抗体质量浓度的确定

采用方阵滴定法来确定单克隆抗体和抗血清配对的最佳工作浓度，结果如表1所示。

当单克隆抗体的包被质量浓度为3.28 µg/mL，抗SEP兔血清的质量浓度为3.14 µg/mL的时候，P/N值最大，达到9.44。

因此确定抗体的最佳配对浓度为单克隆抗体3.28µg/mL，抗血清3.14 mg/L。

表1 不同抗体浓度配对下的OD450 nm值Table 1 The OD450 nm values under different antibody concentrations

2.2 最佳IgG/HRP稀释度的优化

表2 不同羊抗兔IgG/HRP稀释度下的OD450 nm值Table 2 The OD450 nm values of different goat anti-rabbit IgG /HRP dilutions

注：加粗字体为酶标抗体的最佳稀释度。在最佳配对抗体浓度的条件下（即单克隆抗体质量浓度为 3.28µg/mL，抗SEP兔血清质量浓度为3.14 µg/mL），测定酶标抗体稀释度的OD450nm值。如表2所示，当酶标抗体的稀释度为1:3000 时，P/N 值是9.68，因此，确定1:3000 为最佳IgG/HRP 稀释度。

2.3 DAS-ELISA实验条件优化

根据2.1和2.2的实验结果，单克隆抗体的包被浓度为3.28 µg/mL，抗SEP兔血清的浓度为3.14 µg/mL，羊抗兔IgG/HRP的稀释度为1:3000，在此体系下对包被缓冲液、封板时长、抗原孵育时间、酶标二抗反应时间和TMB显色时间进行优化，表3为实验结果。根据P/N值最大的标准选择最优条件。因此，最终选择包被缓冲液为1×PBS（pH 7.4），封闭时间为1 h，抗原孵育时间为90 min，酶标二抗反应时间为30 min，TMB显色时间为15 min。

表3 实验条件的优化Table 3 Optimization of experimental conditions

注：加粗字体为最佳实验条件。

2.4 新型肠毒素SEP的检测标准曲线

图1 SEP双抗夹心酶联免疫法的标准曲线Fig.1 Standard curve of SEP double-antibody sandwich enzyme-linked immunoassay

根据2.1，2.2和2.3的实验结果，在最优条件下，选取不同浓度的SEP纯品蛋白制作标准曲线，并进行线性回归分析，标准曲线的回归方程是y=0.0313x+0.0262，R²=0.9946。SEP的DAS-ELISA方法适用检测范围是0.625～20 μg/mL。

2.5 建立方法的灵敏度实验结果

采用所建立的实验方法，测定不同质量浓度的SEP蛋白纯品，测定OD450nm，并计算P/N值。结果如表4所示。当蛋白浓度为1.8 μg/mL时，P/N值为2.03，根据 P/N值大于 2的标准，本研究建立的DAS-ELISA方法的实际检测灵敏度为1.8 μg/mL。

2.6 精密度实验结果

SEP的DAS-ELISA检测方法的精密度实验结果如表5所示，由表5可以看出，批内变异系数均小于6%，批间变异系数均小于15%，说明此方法具有较好的重复性。

表4 检测SEP的灵敏度实验Table 4 The sensitivity of SEP detection

表5 精密度实验结果Table 5 Precision experiment results

2.7 DAS-ELISA方法的特异性结果

利用所建立的DAS-ELISA方法对实验室保存的金黄色葡萄球菌肠毒素K、I和M纯品进行检测，检测结果如表6所示，P/N＜2.0，检测结果均为阴性，说明该方法与金黄色葡萄球菌其他肠毒素蛋白之间不交叉。

表6 特异性实验结果Table 6 Specific experimental results

2.8 人工污染样品中SEP的回收率试验结果

通过将牛肉糜、熟米饭、LB肉汤中添加适当浓度的SEP纯品蛋白，采用建立的检测方法检测样品中SEP的回收率。从表7可以看出，牛肉糜、熟米饭、LB肉汤样品中SEP蛋白都具有较好的回收率，接近90%及以上。并且三种污染样品中SEP的回收率随着添加浓度的增加而增高，虽然存在样品本身的差异性，但也能很好说明建立的方法具有较高准确度。

表7 人工污染样品的回收率Table 7 Recovery of artificial contaminated samples

3 讨论

ELISA方法具有灵敏度高，特异性好，检测成本低等优点，已经在生物、化学、医学等领域有了广泛应用[14]。目前文献报道的相关金黄色葡萄球菌肠毒素的检测也采用了该方法，如Morissette等[15]建立检测奶酪中肠毒素SEB的夹心ELISA方法，市场上也有相应试剂盒销售，经过改良后其灵敏度可达到 0.5 ng/mL。又如Rahimi等[16]检测生牛乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A的时候采用了ELISA试剂盒，灵敏度达到了0.2 ng/mL。但是，这些方法的建立和试剂盒的应用大部分集中在对传统金黄色葡萄球菌肠毒素 A-D的检测上。而针对新型肠毒素检测方法的研究相对比较少。

随着研究的不断发展，开发针对新型肠毒素蛋白的检测手段具有必要性。近年来，Nagaraj等[8]、朱安妮等[9]和Zhao等[10]分别建立了检测肠毒素SEG、SEI和SEM的夹心ELISA方法。这些方法不断丰富了调查金黄色葡萄球菌肠毒素污染食品的检测手段。

本研究也建立了一种检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEP的DAS-ELISA方法，该方法在0.625～20 μg/mL范围内都具有较好的线性关系，建立方法的灵敏度为1.8 μg/mL，通过批内变异系数和批间变异系数以及人工加标的回收率实验，证实建立的方法具有较好的重复性和稳定性，可用于金黄色葡萄球菌肠毒素P的定量检测，也将具有良好的应用前景。

在进行实验条件优化时，我们发现单抗和多抗的浓度并不是添加量越高效果就越好，抗体浓度过高，会增加体系中的非特异性反应，同时也会影响单抗的抗原表位，降低抗原抗体复合物的形成，使OD450nm降低。但如果抗体浓度过低，又会使抗原的结合位点减少，造成测量值比实际值低。本研究中使用的单克隆抗体的包被浓度为3.28 µg/mL，抗SEP兔血清的浓度为3.14 µg/mL。同时，封闭时间、抗原孵育时间、二抗反应时间和TMB底物显色时间也会对实验结果产生影响，一般来说TMB显色时间越长，颜色越深，OD450nm值越高。但如果延长显色时间也会使阴性孔的值升高，使P/N值反而降低，这与朱安妮等[9]的发现相似，本研究优化的显色时间为15 min。另外，食品基质的复杂性也会影响实验的结果，在加标回收实验中发现，对于牛肉糜和熟米饭这两种基质来说，SEP的浓度越高，回收率越好，而LB肉汤的回收率在不同SEP的浓度下都较好。以后可进一步探索样品的前处理手段和方法，以进一步降低待测基质本身对实验结果影响。还有在特异性实验中，我们把实验室保存的金黄色葡萄球菌肠毒素K、I和M蛋白进行对照检测，发现肠毒素K、I和M与肠毒素P之间不存在交叉反应，这是一个很好的结果。但本研究也还存在一定的缺陷，建立的方法的检测限不够灵敏，在今后的研究中我们将进一步优化条件，并且将建立更加丰富的样品评价方案。

综上所述，本研究初步建立了一种检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEP的DAS-ELISA方法，该方法可用来检测被金黄色葡萄球菌污染食品中的SEP含量，将具有一定的应用前景和借鉴意义。

4 结论

本研究建立了一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素P的双抗夹心ELISA方法；该方法的回归方程为y=0.0313x+0.0262，R²=0.9946；该方法检测SEP毒素的灵敏度为1.8 μg/mL，精密度批内变异低于6%，批间变异低于15%，对LB肉汤、牛肉糜和熟米饭回收率可达90%以上。

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