牛乳中不同部分蛋白质的组成及功能分析

杨梅，武俊瑞，彭秀明，王骏逸，刘彪，岳喜庆

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳 110866）（2.内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古呼和浩特 010050）

牛乳中含有丰富的营养物质，这些营养物质能够很好的被人体消化和吸收。牛乳中所含有的功能性营养成分不仅可以促进婴幼儿的生长发育，还能够提高机体的免疫能力，被广泛应用在乳制品及功能性产品中[1～3]。乳蛋白是牛乳中的最重要的成分之一，其含量约为3.0%～3.7%，是目前人类膳食蛋白质的重要来源[4～5]。牛乳中的蛋白质含有人体生长发育所需要的全部必需氨基酸，数量充足，比例适当，能够维持人体的健康[6]。牛乳中的蛋白质具有较高的营养价值，并且这些蛋白存在多种潜在的生物学功能。因此，牛乳蛋白是评价牛乳质量的重要指标。牛乳蛋白可以分为乳脂肪球膜（Milk fat globule membranes, MFGM）蛋白、乳清蛋白、酪蛋白、乳粒蛋白，这些蛋白质在组成上各不相同[7-9]。

乳脂肪球（MFG）是以一种微小的球状物存在于乳中，其直径大约为0.2～15.0 μm，外面被一层很薄的膜包围，这层膜被称之为乳脂肪球膜（MFGM）[10]。MFGM中含有25%～60%的蛋白质，这些蛋白质占牛乳中总蛋白的1%～2%左右[11～12]。牛乳中的MFGM蛋白具有抗癌[13～15]、降低胆固醇[16～17]、防止幽门螺杆菌感染[18]、提高脑脊髓炎自身免疫[19]等作用。

乳清蛋白约占牛乳蛋白质的20%左右，而乳清中的蛋白质主要包括：β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、蛋白酶、免疫球蛋白等[20]。由于乳清蛋白具有较高的吸收性、完整的氨基酸成分、低脂肪、低胆固醇，还浓缩了牛乳中大多数的营养成分，不仅能够促进身体健康，还可以抗衰老、促进心脏健康、抗癌、提高免疫力、提高骨质和控制体重，是目前最食用的蛋白质补充产品[21-22]。而酪蛋白能够防止钙的流失和沉淀，并且能够帮助人体更好吸收钙元素。

乳粒是来源于细胞分泌的直径为40～100 nm内吞作用的膜囊泡[23]。乳粒中主要含有蛋白质、脂肪、mRNA、miRNA，这些物质能够转移到细胞内并赋予细胞新的功能及信号转导[24]。乳粒作为细胞外的细胞器，在细胞内的信息传递、免疫功能以及作为疾病的生物标记物的来源上具有重要的作用[25]。而乳粒蛋白作为乳粒的主要成分之一，同样具有非常重要的作用。

近年来，对牛乳的研究主要是集中在乳清蛋白，而对 MFGM 蛋白以及乳粒蛋白的研究却很少，对这些蛋白进行深入的研究不但能够提高牛乳的利用率，还能够了解牛乳中蛋白质的功能性质。因此，本研究利用SDS-PAGE电泳将牛乳中的MFGM蛋白、乳清蛋白、乳粒蛋白进行分离，并经过酶解后质谱鉴定，将鉴定后的结果通过GO功能注释以及KEGG代谢通路分析，深入了解牛乳中不同部分蛋白质的组成及功能差异。

1 材料与方法

1.1 原料

采集30份健康奶牛的牛乳并在实验前进行混合，由沈阳辉山乳业奶牛场提供。

牛血清蛋白，北京索莱宝科技有限公司；测序级胰蛋白酶，上海雅心生物有限公司；丙酮、Na2HPO4、NaH2PO4、冰醋酸、考马斯亮蓝 G-250、DTT、碳酸氢铵、甲酸、乙腈，北京鼎国生物试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机，上海翼悾机电有限公司；超声波清洗器，北京佳源兴业科技有限公司；真空冷冻干燥机，上海比朗仪器制造有限公司；小型垂直电泳槽：美国 Bio-Rad公司；毛细管高效液相色谱，美国Agilent；LTQ VELOS质谱仪，赛默飞世尔科技。

1.3 实验方法

1.3.1 牛乳中不同部分蛋白质提取[7,26]

取50 mL乳样，在4 ℃，10000 r/min离心15 min，分离获得乳脂肪部分（MFGM）和下层乳清、乳粒部分。将上层的乳脂肪用 PBS清洗三次，每次清洗时80 W超声15 min。将清洗后的乳脂部分在4 ℃，12000 r/min离心30 min，收集上层样品，即为MFGM样品，然后加入适量预冷的丙酮沉淀，收集 MFGM 蛋白样品，冻干待用。下层的样品即乳清、乳粒部分，继续在4 ℃，12000 r/min离心45 min，收集上清样品，沉淀即为乳粒样品的粗提物。上清样品利用等电点法除去酪蛋白后，即为乳清部分。加入适量预冷的丙酮沉淀，收集乳清蛋白样品，冻干待用。

将乳粒粗提物加入10 mL PBS重悬，在4 ℃，12000 r/min离心45 min收集沉淀，此过程重复三次，清洗过后的沉淀即为乳粒。将乳粒加入适量预冷的丙酮沉淀，收集乳粒蛋白样品，冻干待用。

1.3.2 牛乳中不同部分蛋白质的SDS-PAGE电泳分析

将提取的MFGM、乳清、乳粒蛋白分别加入裂解液（含8 M尿素，2 M硫脲，4% CHAPS）并置于冰盒上裂解，裂解后的蛋白利用Bradford法进行定量，牛血清蛋白为标准蛋白[27]。分别取10 μL上样，采用5%的浓缩胶、12%的分离胶进行SDS-PAGE电泳[28]。

1.3.3 蛋白样品酶解

每组样品取200 μg进行酶解，使用HU buffer调整样品体积为40 μL。加入DTT至终浓度为10 mM，37 ℃孵育1.5 h后加入IAA至终浓度50 mM，600 r/min振荡1 min，避光室温30 min。每个样本加入100 μL 25 mM碳酸氢铵溶液，混匀后加入2 μg的Lysyl C，室温反应3小时。再向反应体系中加入250 μL 25 mM碳酸氢铵溶液，加入 10 μL Trypsin（20 μg Trypsin in 50 μL Dissolution buffer），600 r/min 振荡 1 min，37℃ 16 h，使用C18柱进行脱盐，脱盐样本取1 μL进行MALDL TOF质谱分析。样本脱盐冻干之后使用0.1%的FA复溶，OD280肽段定量，取3 μg样本进行后续ESI质谱鉴定实验。

1.3.4 毛细管高效液相色谱

液相A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈为84%）。色谱柱0.15 mm*150 mm（RP-C18）（Column Technology Inc.）以95%的A液平衡。样品由自动进样器上样到 Zorbax 300SB-C18 peptide traps（Agilent Technologies, Wilmington, DE），再经色谱柱分离，相关液相梯度如下：0 min-50 min，B液线性梯度从4% 到50%；50 min-54 min，B液线性梯度从50% 到100%；54 min-60 min，B液维持在100%。

1.3.5 ESI质谱鉴定及数据分析

酶解产物经毛细管高效液相色谱脱盐及分离后用LTQ VELOS质谱仪（Thermo Finnigan, San Jose, CA）进行质谱分析。进样方式：Microspray，毛细管温度：200度，检测方式：正离子。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描（full scan）后采集20个碎片图谱（MS2 scan）。

利用Proteme Discoverer 1.4和Sequest软件搜索相应的数据库，最后得到鉴定的蛋白质结果。搜索使用的数据库为 uniprot，结果过滤参数为：charge=1，XCorr≥1.5 ； charge=2 ， XCorr≥2.0 ； charge=3 ，XCorr≥2.25，Delta cn＜0.1。

1.3.6 GO功能注释及KEGG代谢通路分析

Gene Ontology（GO）数据库包含了生物过程（Biological Process）、分子功能（（Molecular Function）和细胞组成（Cellular Component）三方面的功能信息。利用DAVID Bioinformatics Resources在线工具进行数据库查询及检索，得到GO功能信息及KEGG代谢通路结果。

2 结果与讨论

2.1 SDS-PAGE电泳结果分析

图1 牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白的SDS-PAGE电泳图Fig. 1 SDS-PAGE chart of MFGM，whey, exosome protein in milk

将提取的牛乳中 MFGM 蛋白、乳清蛋白、乳粒蛋白进行SDS-PAGE电泳分析[9]，结果如图1所示。由牛乳中蛋白质不同组成部分的电泳图可以看到，蛋白质在组成及含量上并不完全相同。而MFGM、乳清、乳粒蛋白中酪蛋白含量较高，掩盖了一些低丰度蛋白的表达，可能是由于酪蛋白存在于MFGM、乳粒中[29]。在牛乳中MFGM、乳清、乳粒含有一些相同表达蛋白，如果将MFGM、乳粒蛋白充分利用在乳制品加工中能够增加牛乳的利用率与利用价值。

2.2 牛乳中蛋白质不同组成部分酶解后的鉴定结果分析

图2 A1YQB2-DDQNPHSSNICNISCD的二级质谱图Fig.2 Two stage mass spectrometry of the A1YQB2-DDQNPHSSNICNISCD

图3 牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白组成Fig.3 Compositions of MFGM，whey, exosome protein in milk

将牛乳中蛋白质不同组成部分酶解后的肽段进行液质联用分析，然后进入数据库进行比对。研究表明，具有Unique Peptides完整肽段的蛋白质鉴定结果具有极高的可信度[30]。图 2所示是 Uniprot登录号为A1YQB2（α-乳白蛋白）的二级质谱图。本文中牛乳蛋白的Unique Peptides≥1的总共鉴定出244种蛋白，其中牛乳的Unique Peptides最多可达到43种，说明本实验的鉴定结果具有较高的可信度。如图3所示，MFGM鉴定出201种，乳清鉴定出96种，酪蛋白鉴定出21种，乳粒中鉴定出43种。结果表明，MFGM蛋白质的种类明显高于乳清、乳粒蛋白。虽然乳清蛋白是目前应用最为广泛的乳制品原料，但是MFGM、乳粒作为原料同样具有较高的利用价值。

2.3 牛乳中蛋白质不同组成部分组成对比分析

图4 牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白的维恩图Fig. 4 The Venn diagram of MFGM，whey, exosome protein in milk

如图4所示，有27种蛋白质在这三部分都有表达，MFGM中有140种特异性表达蛋白，乳清中有33中特异性表达蛋白，乳粒中有3种特异性表达蛋白。这也说明，牛乳中MFGM、乳清、乳粒在蛋白质组成上并不完全相同，而 MFGM 蛋白中含有特异性表达蛋白种类较多。这与Timothy的分类及比较方法类似，从不同角度诠释的牛乳中蛋白质的组成[7]。因此对牛乳中不同组成部分蛋白质的组成进行深入研究，能够为日后利用MFGM、乳粒蛋白为原料生产乳制品提供理论依据。

2.4 GO功能注释分析

2.4.1 牛乳中蛋白质不同组成部分参与的生物过程分析

如图5所示，通过对牛乳中蛋白质数据库的检索，选择主要的生物过程。牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白的生物过程主要是生物调控（biological regulation）、细胞组成（cellular component）、细胞定位（localization）、细胞定位的建立（establishment of localization）、传导（transport），而牛乳中酪蛋白主要参与细胞定位、细胞定位的建立以及传导。通过对生物过程的分析可知，牛乳中 MFGM 蛋白在生物过程中发挥的作用要高于乳清和乳粒蛋白，尤其体现在生物调控中的作用。Timothy同样将乳中不同部分蛋白质进行生物过程归类分析，并进行比较，分析了不同部分蛋白质在生物过程中发挥作用的差异[7]。

图5 牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白的生物过程Fig. 5 Biological processes of MFGM，whey, exosome protein in milk

2.4.2 牛乳中蛋白质不同组成部分参与的分子功能分析

图6 牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白的分子功能Fig.6 Molecular Function of MFGM，whey, exosome protein in milk

如图6所示，牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白的分子功能主要为结合（binding）、酶调节活性（enzyme regulator activity）、转运活性（transporter activity）、抗氧化活性（antioxidant activity）、蛋白二聚体活性（protein dimerization activity），酪蛋白主要参与转运活性和抗氧化活性。其中结合作用是牛乳中不同部分蛋白质的主要的分子功能，而 MFGM 蛋白质的结合作用最高，可能MFGM蛋白参与膜的结合作用有关。而乳粒蛋白参与的转运活性分子功能高于MFGM、乳粒蛋白，可能与乳粒的转运作用有关。

2.4.3 牛乳中蛋白质不同组成部分的细胞组成分析

如图 7所示，牛乳中 MFGM、乳清、乳粒蛋白主要参与的细胞组成为膜（membrane）、细胞内部分（intracellular part）、细胞外部分（extracellular region）、蛋白质-脂类复合物（protein-lipid complex）、细胞表面（cell surface），而酪蛋白主要参与细胞外部分。其中乳粒蛋白参与较多的细胞组成为膜，这与乳粒本身为膜囊泡有关。 与乳清、乳粒蛋白相比MFGM 蛋白参与的细胞组成均较多，这也说明了MFGM蛋白具有较高的利用价值。

图7 牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白参与的细胞组成Fig.7 Cellular Component of MFGM，whey, exosome protein in milk

2.5 牛乳中蛋白质不同组成部分的 KEGG代谢通路分析

如表1，表2所示，牛乳中蛋白质不同组成部分中有22种蛋白参与KEGG代谢通路，包括：过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路（PPAR signaling pathway）、补充和凝血结合（Complement and coagulation cascades）、半乳糖代谢（Galactose metabolism）、囊泡运输中SNARE相互作用（SNARE interactions in vesicular transport）、钙信号通路（Calcium signaling pathway）、长时程增强（Long-term potentiation）。MFGM 蛋白参与的代谢通路为PPAR信号通路、囊泡运输中SNARE相互作用、钙信号通路、长时程增强；乳清蛋白与的代谢通路为 PPAR信号通路、补充和凝血结合、半乳糖代谢；乳粒蛋白参与的代谢通路为 PPAR信号通路。MFGM、乳清、乳粒蛋白均参与的代谢通路为 PPAR信号通路，如图8所示。这也是从代谢角度说明了牛乳中不同部分蛋白质组成有相同的一部分，也有较多的不同。

图8 MFGM、乳清、乳粒蛋白均参与的PPAR信号通路Fig. 8 Proteins involved in PPAR signaling pathway of different component protein parts in milk

表1 牛乳中蛋白质不同组成部分的KEGG代谢通路Table 1 KEGG Pathway of the different component protein parts in milk

表2 参与KEGG代谢通路的蛋白Table 2 Proteins involved in KEGG pathway

P11151 脂蛋白脂酶 478 53.3 8.51 Q32PA1 CD59分子，补体调节蛋白 121 13.7 7.75 A6QPX7 纤维蛋白原β蛋白 330 37.9 6.68 Q3SZZ9 纤维蛋白原γ蛋白 435 49.1 5.87 P34955 α-1-抗蛋白酶 416 46.1 6.52 Q3T000 突触同源YKT6蛋白 198 22.5 6.58 Q2T9M8 突触相关蛋白同种型SNAP23A 211 23.2 4.83 Q0II86 突触相关蛋白 258 28.5 5.47 P04896 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白 394 45.7 5.71 Q3SYS6 钙调磷酸酶B同源蛋白 195 22.4 5.10 Q08E45 钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα 478 54.1 7.08 P38408 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α亚基 355 41.5 6.07 P30546 组胺H1受体 491 55.9 8.97 P61223 Ras相关蛋白Rap-1b蛋白 184 20.8 5.78 P08037 β-1,4-半乳糖转移酶 402 44.8 9.31 P00711 α-乳清蛋白 142 16.2 5.14

3 结论

3.1 牛乳中 MFGM、乳清、酪蛋白、乳粒中的蛋白质在组成及含量上存在一定的差异，MFGM中鉴定出201种蛋白质，乳清中鉴定出96种蛋白质，酪蛋白中鉴定出21种蛋白，乳粒中鉴定出33种蛋白质。其中只有27种相同的蛋白，说明牛乳中不同部分蛋白组成存在较大的差异。通过分别对MFGM、乳清、酪蛋白、乳粒中的蛋白质的GO功能注释及KEGG代谢通路分析表明，牛乳中MFGM、乳清、酪蛋白、乳粒中的蛋白质在生物学过程、分子功能、细胞组成及代谢通路上同样存在较大的差异。其中，MFGM蛋白参与的功能及代谢通路要高多于乳清与乳粒，这说明牛乳MFGM蛋白具有较高的利用价值，可能会作为原料为日后生产乳制品提供参考依据。对牛乳中蛋白质不同组成部分进行探究，能够深入的了解牛乳中的蛋白质分布情况，以及不同组成部分蛋白质的功能，有利于提高牛乳的利用率。然而，通过SDS-PAGE的结果显示，MFGM、乳清、乳粒中酪蛋白含量较高，这样会影响一些低丰度蛋白的表达。因此，想要更深入的了解牛乳中不同部分蛋白质在组成及含量上的差异还有待更进一步的研究。

3.2 目前，母乳并不能完全满足婴幼儿的需求，市场上以牛乳为替代品，主要是由于牛乳中乳蛋白的价值较高。而当前主要是以乳清蛋白中几种功能性蛋白为主，但是越来越多的研究发现单一的乳清蛋白并不能完全满足婴幼儿的需要[31]。因此，对牛乳中MFGM、乳清、乳粒蛋白质在组成上全面的研究也越来越重要。

通过鉴定结果可以看出牛乳中不同部分蛋白质在组成上差异较大，主要是由于高丰度蛋白的存在，大大影响到了一些低丰度乳蛋白的表达[32]。

3.3 牛乳中MFGM蛋白质的种类明显高于乳清与乳粒蛋白，这说明 MFGM 蛋白在机体内发挥的作用可能更加重要，所以对 MFGM 蛋白的加工与利用尤为重要。而乳粒蛋白种类比较低，这可能与乳粒表面的酪蛋白没有完全除去有关，掩盖了乳粒中低丰度蛋白的表达。MFGM蛋白参与的生物调控过程较多，说明MFGM 蛋白主要在生物大分子间的相互识别与相互作用。乳粒蛋白参与的转运活性的分子功能较高，这可能与乳粒本身能够将蛋白质转运到细胞内并进行信号传导有关。而乳清蛋白在GO功能中的作用较为全面，比例较为适中。牛乳中不同部分蛋白质参与的PPAR signaling pathway主要是通过调节靶基因的表达产生生物效应，能够调节脂肪细胞分化和能量代谢的关键性转录因子。因此牛乳中蛋白质参与的 PPAR signaling pathway在机体内起着非常重要的作用。

[1]Barbano D M, Ma Y, Santos M V. Influence of raw milk qualityon fluid milk shelf life. [J]. Journal of Dairy Science,2006, 89(1): E15-19

[2]Forsback L, Lindmark-Mansson H, Svennersten-Sjaunja K,et al. Effect of storage and separation of milk at udder quarter level on milk composition, proteolysis, and coagulation properties in relation to somatic cell count. [J]. Journal of Dairy Science, 2011, 94(11): 5341-5349

[3]Forsback L, Lindmark-Mansson H, Andren A, et al.Evaluation of quality changes in udder quarter milk from cows with low-to-moderate somatic cell counts. [J]. Animal,2010, 4(4): 617-626

[4]Gagnaire V, Jardin J, Jan G, et al. Proteomics of milk and bacteria used in fermented dairy products: from qualitative to quantitative advances [J]. Journal of Dairy Science, 2009, 92(3): 811-825

[5]陈静廷,马露,杨晋辉,等.差异蛋白质组学在乳蛋白研究中的应用进展[J].动物营养学报,2013,25(8):1683-1688 CHEN Jing-ting, MA Lu, YANG Jin-hui, et al. Differential proteomics application in milk protein research [J]. Animal Science, 2013, 25(8): 1683-1688

[6]Anna Haug, Arne T.H stmark, Odd M Harstad, et al. Bovine milk in human nutrition-a revie [J]. Lipids in Health and Disease, 2007, 6(25): 1-16

[7]Timothy A, Reinhardt, Randy E, et al. Bovine milk proteome:Quantitative changes in normal milk exosomes, milk fat globule membranes and whey proteomes resulting from Staphylococcus aureus mastitis [J]. Journal of proteomics,2013, 82: 141-154

[8]Timothy A, Reinhardt, John D, et al. Bovine milk exosome proteome [J]. Journal of proteomics, 2012, 75(5): 1486-1492

[9]石磊,刘晓梅,程舸,等.人乳中蛋白质的组成分析[J].应用化学,2010,27(9):1099-1104 SHI Lei, LIU Xiao-mei, CHENG Ge, et al. The analysis of human milk protein composition [J]. Applied Chemistry,2010, 27(9): 1099-1104

[10]D'Alessandro A, Scaloni A, Zolla L. Human milk proteins: an interactomics and updated functional overview [J]. Journal of Proteome Research, 2010, 9(7): 3339-3373

[11]D'Alessandro A, Zolla L, Scaloni A. The bovine milk proteome: cherishing, nourishing and fostering molecular complexity. An interactomics and functional overview [J].Molecular Biosystems, 2010, 7(3): 579-597

[12]Davies C R, Morris V, Griffiths V, et al. Proteomic analysis of the mouse mammary gland is a powerful tool to identify novel proteins that are differentially expressed during mammary development [J]. Proteomics, 2006, 6(21): 5694-5704

[13]Spitsberg V L, Gorewit R C. Isolation, purification and characterization of fatty-acid-binding protein from milk fat globule membrane: effect of bovine growth hormone treatment [J]. Pak. J. Nutr., 2002, 1(1): 43-48

[14]Spitsberg V L, Gorewit R C. Breast ovarian cancer susceptibility protein (BRCA1) in milk, tissue and cells [J]. J.Dairy Sci., 1997, 80: 60-69

[15]Vesper H, Schmel E M, Nikolova D L, et al. Sphingolipids in food and the emerging importance of sphingolipids to nutrition [J]. J. Nutr., 1999, 129(7): 1239-1250

[16]Ito O, Kamata S, Hayashi M, et al. Inhibitory effect of cream and milk fat globule membrane on hypercholesterolemia in the rat [J]. Anim Sci Technol, 1992, 63: 1022-1027

[17]Noh S K, Koo S L. Milk Sphingomyelin is more effective than egg sphingomyelin in inhibiting intestinal absorption of cholesterol and fat in rats [J]. J. Nutr., 2004, 134(10): 2611-2616

[18]Wang X, Hirmo S, Millen R, et al. Inhibition of helicobacter pylori infection by bovine milk glycoconjugates in a BALB/cA mouse model [J]. J. Med. Microbiol., 2001, 50(5):430-435

[19]Stefferl A, Schubri A, Storch M, et al. Butyrophilin, a milk protein, modulates the encephalitogenic t cell response to myelin oligoddendrocyte glycoprotein in experimental autoimmune encephalomyelitis [J]. J. Immunol., 2000,165(5): 2859-2865

[20]Alomirah H F, Alli I. Separation and characterization of β-lactoglobulin and α-lactalbumin from whey and whey protein preparations Inter. Dairy J., 2004, 14(5): 411-419

[21]Krissansen G.W. Emerging health properties of whey proteins and their clinical implications. [J]. J. Am. Coll. Nutr., 2007,26(6): 713S-723S

[22]Marshall K. Therapeutic applications of whey protein [J].Alternative Medicine Review. 2004, 9(2): 136-156

[23]Hata T, Murakami K, Nakatani H, et al. Isolation of bovine milk-derived microvesicles carrying mRNAs and microRNAs [J]. Biochem Biophys Res. Commun., 2010,396(2): 528-533s

[24]Lasser C, Seyed Alikhani V, Ekstrom K, et al. Human saliva,plasma and breast milk exosomes contains RNA: uptake by macrophages [J]. J. Transl. Med., 2011, 9(9): 2-8

[25]Lakkaraju A, Rodriguez-Boulan E. Itinerant exosomes:emerging roles in cell and tissue polarity [J]. Trends. Cell.Biol., 2008, 18(5): 199-209

[26]Reinhardt T A, Lippolis J D. Bovine milk fat globule membrane proteome [J]. J. Dairy Res., 2006, 73(4): 406-416

[27]Bradford M M. Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding [J]. Electrophoresis, 1986, 7(1): 52-54

[28]Singh H, The milk fat globule membrane e a biophysical system for food applications [J]. Current Opinion in Colloid and Interface Science, 2006, 11(2-3): 154-163

[29]Ye A, Singh H, Taylor M W, et al. Interactions of fat globule surface proteins during concentration of whole milk in a pilot-scale multiple effect evaporator [J]. Journal of Dairy Research, 2004, 71(4), 471-479

[30]魏开华,应天翼,胡良平,等蛋白质组学实验技术精编北京:化学工业出版社,2010

[31]Mange A, Bellet V, Tuaillon E, et al. Comprehensive proteomic analysis of the human milk proteome: contribution of protein fractionation [J]. J. Chromatogr B. Analyt. Technol.Biomed Life Sci., 2008, 876(2): 252-256

[32]Smolenski G, Haines S, Kwan F.Y, et al. Characterisation of host defence proteins in milk using a proteomic approach [J].J. Proteome Res., 2007, 6(1): 207-215