野生猕猴桃与维生素C对大鼠酒精性肝脑损伤的预防性保护作用

陈霞，张锐，胡锴，罗婷婷，郭文博，杨艳

（1.西南医科大学公共卫生学院预防医学专业，四川泸州 646000）（2.西南医科大学公共卫生学院营养与食品卫生教研室，四川泸州 646000）

猕猴桃（Actinidia chinensis Planch）为猕猴桃属（Actinidia Lindl）植物，又称狐狸桃、藤梨、羊桃、木子、毛木果和奇异果等。其果实营养丰富、风味独特，在世界上消费量最大的前26种水果中，猕猴桃的营养最为丰富全面，含有人体必需的多种氨基酸和矿物质，尤其维生素C含量十分丰富，被称为水果中的“维生素C之王”。在我国，野生猕猴桃主要分布在黑龙江地区、两广地区、秦岭北麓、浙江东部、贵州西南、四川川南以及河南等地，产量巨大，品种丰富。野生猕猴桃中各营养及功能成分含量均高于市面上出售的人工培植的猕猴桃[1]。由于其长在荒无人烟的深山中，交通不便，采摘困难，加之口感偏酸，仅有少数当地人食用，绝大部分野生猕猴桃资源没有被利用，十分可惜，因此，合理开发使用这宝贵资源非常必要。

过量饮酒及酗酒对人类健康的危害正成为日益严重的社会问题，长期大量饮酒可导致人体多器官、多系统损害，其中以肝、脑受损最为严重[2]。研究表明，酒精可通过不同的机制导致脂质过氧化反应、氧化应激和细胞凋亡引起肝脑损伤[3,4]。由于目前尚无治疗酒精中毒所致肝脑损伤的有效药物，因而近年来如何防治酒精性肝脑损伤已成为研究热点。维生素C和猕猴桃提取物均具抗氧化、脂质过氧化的作用[5]。研究采用酒精灌胃法建立大鼠酒精性肝脑损伤模型，分别给予野生猕猴桃饲料和添加等量维生素C的维生素C强化饲料干预，比较二者对大鼠酒精性肝脑损伤的预防性保护作用，为野生猕猴桃在药用、营养及保健方面的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

40只SD雄性健康大鼠，体重180～220 g，由西南医科大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证SCXK(川)2013-17；实验动物使用许可证SYXK(川)2013-065。

1.1.2 主要仪器与试剂

Versamax连续波长酶标仪，美国分子仪器公司；UV-2450紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；5810R冷冻型台式大容量高速离心机，德国eppendorf公司；LD4-2A型台式低速离心机，北京众益中和生物技术有限公司；HH-8数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司。

56°红星二锅头白酒，北京红星股份有限公司；四川省宜宾县野生猕猴桃；维生素C，纯度99%，北京索莱宝科技有限公司；谷丙转氨酶(Alaninea minotransferase，ALT)、谷草转氨酶(Aspartate transaminase，AST)、甘油三酯（Triglyceride，TG）、总胆固醇（Serum total cholesterol，TC）、过氧化脂质（Lipid Peroxidation，LPO）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、总蛋白（Total protein，TP）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组

大鼠适应性喂养一周后，将40只SD大鼠按体重随机均分为4组，分别为正常组、模型组、维生素C组（以下简称Vc组）和野生猕猴桃组（以下简称猕猴桃组）。

1.2.2 饲料的制备

1.2.2.1 野生猕猴桃饲料的制备

野生猕猴桃饲料制备参照张燕[6]等的方法进行。将野生猕猴桃洗净去皮打成果浆，以30%的比例与粉末状普通大鼠饲料混匀成糊状，用10 mL注射器制成大小适度均一的饲料，自然风干，低温储存。

1.2.2.2 维生素C强化饲料的制备

检测四川省宜宾县野生猕猴桃维生素 C含量为1200 mg/kg，野生猕猴桃含水量为50%，30%猕猴桃饲料因添加猕猴桃维生素C增加的量约为420 mg/kg，因此，按420 mg/kg将维生素C添加到粉状普通饲料中制成维生素C强化饲料。

1.2.3 造模与干预

张宇等采用白酒灌胃2周造成大鼠酒精性肝脑损伤[7,8]，因此实验采用白酒灌胃2周造模：除正常组给予等量生理盐水灌胃外，其余各组连续灌胃56 °红星二锅头建立酒精性肝脑损伤模型（第一周白酒剂量为8 mL/kg，第二周为10 mL/kg），每天1次，同时正常组、模型组给予普通饲料，Vc组和猕猴桃组分别给予维生素C强化饲料和野生猕猴桃饲料。

1.2.4 标本的采集、制备和检测

禁食12 h后称重，用1%戊巴比妥钠40 mg/kg(4 mL/kg)麻醉大鼠，腹主动脉采血，将取得的血液室温下静置40 min，3000 r/min离心10 min，取上清液待测。迅速取部分肝脑组织，分别用10%福尔马林液固定，石蜡包埋并切片，HE染色，普通光学显微镜下观察。取部分脑组织精确称量后加入生理盐水制成10%的脑匀浆，3000 r/min离心10 min后取上清液待测。按试剂盒说明书测定血清ALT、AST、TG、TC、LPO和脑匀浆TP、SOD、MDA。

1.3 数据处理

用Excle 2003录入并整理实验数据，SPSS 22.0统计软件进行分析。资料采用进行统计描述，单因素方差分析进行统计推断，LSD法进行两两比较。以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 行为学表现和病理组织学改变

正常组被毛光滑，活跃，对外界刺激反应灵敏，食欲佳，体重稳定增长，灌胃时反抗少。模型组在灌胃白酒后，随着灌胃天数增加，出现毛发无光泽、反应迟钝、精神萎靡、饮食减少，体重下降、嗜睡，甚至出现翻正反射消失，约0.5～1.5 h后恢复正常，灌胃时挣扎反抗剧烈，有不明原因的摔倒。Vc组、猕猴桃组大鼠精神、食欲及活动状态介于正常组与模型组之间。光镜下可见，正常组大鼠肝小叶结构完整，形态清晰，肝细胞索排列整齐，呈放射状，肝窦正常，肝细胞结构完整；脑组织结构正常，神经细胞胞核清晰，胞质丰富，间质无水肿。模型组大鼠肝小叶界限不清，肝索及肝血窦排列紊乱，肝窦变窄，肝细胞体积增大，明显肿胀，胞质疏松、淡染，核浓缩，出现少量弥漫性大小不等的脂肪空泡。脑组织部分神经细胞排列紊乱，间质可见不同程度水肿，部分神经元体积变小，核固缩成三角形或不规则形，核深染。Vc组、猕猴桃组病理组织学改变与模型组尚未能观察到差异。行为学表现和病理组织学改变说明大鼠酒精性肝脑损伤模型基本构建成功。

2.2 维生素 C与野生猕猴桃对酒精性肝脑损伤大鼠ALT、AST的影响

表1 各组大鼠血清ALT、AST活性（±s，n=10）Table 1 Activities of ALT and AST in rat serum in each group(±s, n=10)

表1 各组大鼠血清ALT、AST活性（±s，n=10）Table 1 Activities of ALT and AST in rat serum in each group(±s, n=10)

注：*表示与正常组比较，p＜0.001；#表示与模型组比较，p＜0.01；▲表示与Vc组比较，p＜0.05。以下同上。

组别 ALT/(U/L) AST/(U/L)正常组 13.36±1.41 81.23±13.17模型组 32.34±2.87* 152.61±21.85*Vc组 23.65±2.29*# 141.19±19.09*猕猴桃组 19.27±1.74*#▲ 122.82± 8.81*#▲

ALT、AST是检验肝脏损伤的一个重要指标，ALT一般主要存在于细胞浆中，而AST则主要存在于细胞质与线粒体中，AST的释放通常被认为是相对严重的肝损伤，因为其可能也暗示着线粒体的损伤，而ALT的释放通常与急性肝细胞受损有关，因此通过检测血清ALT、AST的含量，可反映肝细胞受损情况[9]。由表1可见，与正常组相比，模型血清ALT、AST均显著升高（p＜0.001），说明造模引起大鼠肝脏细胞损伤。与模型组相比，Vc组AST降低，但差异无统计学意义（p＞0.05），ALT 显著降低（p＜0.05），猕猴桃组ALT、AST均显著降低（p＜0.01）；与Vc组相比，猕猴桃组ALT、AST均显著降低（p＜0.05），说明维生素C和野生猕猴桃可减轻酒精造成的肝细胞损伤，且野生猕猴桃作用更明显。

2.3 维生素 C与野生猕猴桃对酒精性肝脑损伤大鼠TG、TC、LPO的影响

表2 各组大鼠血清TG、TC、LPO水平含量（±s，n=10）Table 2 Contents of TG, TC and LPO in rat serum in each group (±s, n=10)

表2 各组大鼠血清TG、TC、LPO水平含量（±s，n=10）Table 2 Contents of TG, TC and LPO in rat serum in each group (±s, n=10)

组别 TG/(mmol/L) TC/(mmol/L) LPO/(μmlo/L)正常组 0.35±0.03 1.28±0.09 1.84±0.63模型组 0.78±0.05* 1.93±0.13* 7.52±0.95*Vc组 0.58±0.05*# 1.75±0.13*# 4.92±0.70*#猕猴桃组 0.53±0.06*#▲ 1.59±0.11*#▲ 4.17±4.19*#▲

酒精可致血脂代谢紊乱，致使肝脏内TG代谢障碍，肝脏对TC合成能力减弱，使血清中TC、TG含量增高[10]。酒精的摄入能够诱发肝脏内微粒体中CYP2E1的高度表达，CYP2E1的高表达能够产生高浓度的氧自由基，氧自由基具有强氧化能力，会攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化，并产生脂质过氧化产物（LPO），破坏生物膜正常结构和功能，最终造成细胞损伤[11]。

由表2可见，与正常组相比，模型组血清TG、TC、LPO均显著升高（p＜0.001），说明造模引起大鼠肝脏脂质代谢紊乱，出现脂质过氧化；与模型组相比，Vc组和猕猴桃组TG、TC、LPO均显著降低（p＜0.01）；与Vc组相比，猕猴桃组TG、TC、LPO均显著降低（p＜0.05）。实验显示，Vc组、猕猴桃组可降低肝细胞TC、TG、LPO含量，减少肝细胞内脂质积累，抑制脂质过氧化程度，阻止肝脏脂肪变性，从而对酒精引起肝损伤发挥预防性保护作用。由于猕猴桃组降低TG、TC、LPO程度优于Vc组，因此野生猕猴桃预防性保护效果优于Vc组。

2.4 维生素C与野生猕猴桃对酒精性肝脑损伤大鼠血清及脑匀浆SOD、MDA的影响

表3 各组大鼠血清及脑匀浆SOD、MDA水平（±s，n=10）Table 3 Activity of SOD and content of MDA in serum and brain homogenate of rats in each group (±s, n=10)

表3 各组大鼠血清及脑匀浆SOD、MDA水平（±s，n=10）Table 3 Activity of SOD and content of MDA in serum and brain homogenate of rats in each group (±s, n=10)

组别 血清 脑匀浆SOD/(U/mL) MDA/(nmol/mL) SOD/(U/mg prot) MDA/(nmol/mg prot)正常组 187.32±10.39 3.70±0.47 679.24±38.31 3.06±0.28模型组 130.07± 6.20* 7.60±0.62* 433.60±24.68* 6.35±0.48*Vc组 150.44± 8.10*# 5.90±0.38*# 494.23±24.68*# 4.45±0.26*#猕猴桃组 152.82± 6.94*#▲ 5.48±0.42*#▲ 525.44±37.36*#▲ 4.08±0.26*#▲

氧化应激是酒精性肝脑损伤最重要的发病机制之一，其中氧自由基对于酒精性肝脑疾病的发生有着重要作用。SOD可通过歧化作用清除体内氧自由基，减少脂质过氧化反应，维持生物膜的正常结构和功能，其水平高低反映机体抗氧化能力的强弱[12]。MDA是脂质过氧化反应的终产物，通过测定其含量可间接推断自由基对机体的损伤程度[13]。由表3可见，与正常组相比，模型组血清和脑匀浆SOD均降低，MDA均升高（p＜0.001）；说明酒精灌胃已造成大鼠肝脏和脑组织氧化损伤，脂质过氧化产物增多。与模型组相比，Vc组和猕猴桃组血清和脑匀浆SOD升高，MDA降低（p＜0.01）；与Vc组相比，猕猴桃组血清和脑匀浆SOD升高，MDA降低（p＜0.05），表明维生素C和野生猕猴桃可通过增加SOD，降低MDA，来抑制氧化应激反应而减轻酒精对大鼠肝脑的损伤作用。由于猕猴桃组增加SOD，降低MDA程度高于Vc组，因此野生猕猴桃效果优于Vc组。

3 结论

3.1 猕猴桃营养成分冠于各种水果之上，含有20种氨基酸、黄酮类化合物、维生素、膳食纤维以及钙、镁、硒、磷、钾等矿质。许多研究表明猕猴桃是一种促进健康的食物，通常将其对人体健康的积极作用与抗氧化化合物(如：维生素 C、黄酮类化合物)的高含量联系起来，尤其是维生素C[6,14]。多数野生猕猴桃保健功效的文献是通过营养成分推测其应有的保健功效，这种推测往往忽略了野生猕猴桃的多种营养物质的联合作用。实验先测定野生猕猴桃中维生素C的含量，再按照野生猕猴桃饲料维生素C的含量在饲料中添加维生素C。因此，实验实质是野生猕猴桃所含多种成分的联合作用与维生素C单独作用的比较。

3.2 研究采用2周梯度浓度酒精灌胃模拟亚急性高剂量饮酒状态复制损伤模型。不少实验表明，急性酒精性肝损伤模型以肝及血中的某些化学指标改变为主要特征[8,12]，慢性酒精性肝损伤则以肝脏组织结构病变

为主要特征[8]，而脑损伤则有行为学、病理学、血液生化学、影像学、脑电图、脑地形图的改变[15]。实验观察到，与正常组相比，模型组大鼠行为学有明显差异，肝脑病理组织学有明显损伤性病变。血清ALT、AST、TG、TC、LPO显著升高（p＜0.001），血清及脑匀浆SOD显著降低，MDA显著升高（p＜0.001），行为学、病理学、血液生化指标表明2周梯度浓度酒精灌胃建立大鼠酒精性肝脑损伤模型是成功的。

3.3 实验发现，与模型组比较，Vc组和猕猴桃组血清ALT、AST、TG、TC、LPO降低，血清及脑匀浆SOD升高，MDA降低（p＜0.01）；与Vc组相比，猕猴桃组大鼠血清ALT、AST、TG、TC、LPO降低，血清及脑匀浆SOD升高，MDA降低（p＜0.05）。表明野生猕猴桃和维生素C均能减轻酒精对肝脑细胞造成的损伤。而野生猕猴桃中所含黄酮类化合物具有抑制自由基的生成、降低脂质过氧化和刺激抗氧化酶的作用，Ca具有抗炎、消肿、抗组织胺作用，Se具有增强机体细胞免疫和体液免疫、延缓衰老、抗肿瘤、保护肝细胞不受肝毒损害的功能[16]，各成分之间是如何起作用如协同、叠加或双向调节等都有待深入研究。实验证实，野生猕猴桃组保护酒精所致肝脑细胞损伤的效果优于维生素C组，其机制与野生猕猴桃中维生素C与猕猴桃其他多种成分的联合作用大于维生素C的单独作用，从而提高机体抗氧化能力，抑制脂质过氧化，增强机体对自由基的防御能力有关。

3.4 综上所述，单纯维生素C和野生猕猴桃均能明显减轻大鼠酒精性肝脑损伤，抑制酒精性肝脑损伤的发展，具有预防性保护作用，且野生猕猴桃的多种成分的联合作用效果优于单纯维生素C。因此，在酒精性肝脑损伤防治中食用野生猕猴桃优于服用维生素C制剂，也说明营养素制剂决不能代替新鲜水果。野生猕猴桃生长在纯野生的环境中，不使用膨大剂、化肥、农药，是真正纯天然绿色的水果，作为“药食同源”天然食品具有巨大的潜在利用价值，是一种值得开发利用的野生植物资源。

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