归芪聪志汤对血管性痴呆大鼠海马缺氧诱导因子-1α、血管内皮生长因子和血红素加氧酶-1表达的影响

张 宣 吴红彦 李海龙 陈 杰 马春林

(甘肃省中医院，甘肃 兰州 730000)

痴呆是由多种原因导致智力功能障碍的一种临床综合征，其中阿尔茨海默病(AD)和血管性痴呆(VD)最为常见，而就目前的临床就诊人群研究结果证明VD高于AD〔1〕。由于临床确诊VD时多为疾病晚期，目前也无特效的治疗药物，近年来学者研究发现，通过中医药治疗可有效改善患者认知功能和行为能力等，并且具有疗效满意、副作用少等众多优势，合理开发中医药治疗痴呆逐渐受到医学研究者的青睐〔2〕。前期临床研究表明归芪聪志汤对于改善VD患者症状有较好疗效，为进一步探讨其作用机制，本实验通过双侧颈动脉结扎法建立VD大鼠模型，观察归芪聪志汤对VD大鼠海马组织血管内皮生长因子(VEGF)、缺氧诱导因子(HIF)-1α和血红素加氧酶(HO)-1表达的影响。

1 资料与方法

1.1动物与分组 SPF级Wistar雌性大鼠，体重(200±20)g，由甘肃中医学院科研实验动物中心提供，许可证号：SYXK(甘)2011-0001。造模前经过Morris水迷宫测试筛选淘汰不合格大鼠后，留取84只健康大鼠；采用随机对照法，将大鼠分为假手术组、模型组、归芪聪志汤高剂量组、归芪聪志汤中剂量组、归芪聪志汤低剂量组、阳性对照组，实验中各组鼠均有缺失。

1.2主要仪器与试剂 Morris水迷宫视频跟踪分析系统(成都泰盟科技有限公司)；兔抗VEGF多克隆抗体(批号：AD090110)、兔抗HO-1多克隆抗体(批号：AD082653)、兔抗HIF-1多克隆抗体(批号：AD072912)、兔抗CD34多克隆抗体(批号：140616)，兔SP检测试剂盒(批号：15121A01)，购自北京博奥森生物技术有限公司；RT-PCR试剂盒(批号：1418J)，Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(批号：10274023)，β-actin(批号：AB10KA4661)，由兰州瑞真生物技术有限公司提供。VEGF正义链引物：5′CCAGGATTTAAACCGGGATTTC3′，反义链引物：5′TCCTGCAGCATAGCAGATGTGA3′，125 bp；HIF-1α正义链引物：5′GCTGTCCACATCAAAGCAGTACTCA3′，反义链引物：5′CCAGATTCAAGATCAGCCAGCA3′，100 bp；HO-1正义链引物：5′CTTCCAGGGCCGTATAGATATGGTA3′，反义链引物：5′AGGTGCACATCCGTGCAGAG3′，120 bp。

1.3药物 归芪聪志汤由黄芪30 g、当归30 g、川芎15 g、石菖蒲15 g、苦参15 g等组成，购自甘肃中医学院附属医院。药物以总体积的8倍量水冷浸3 h，微沸1 h，煎煮2次后合并滤液制成浓度分别为0.66 g、1.32 g、2.64 g生药/ml的水提液，无菌条件装瓶；吡拉西坦胶囊(0.25 g×48片，西安利君方圆制药有限责任公司)，用生理盐水配成30 mg/ml的混悬液，4℃储存备用。

1.4方法

1.4.1动物模型制作 采用改良后的大鼠双侧颈总动脉永久性结扎法〔3〕。大鼠术前12 h禁食，不禁水，用10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉。大鼠麻醉后，将其仰卧固定在手术台，颈前部手术区域去毛，碘酒消毒，颈部正中切开皮肤及皮下组织，取颈前正中切口，钝性分离皮下结缔组织、颈前肌群，仔细分离暴露左侧CCA，以“0”号丝线结扎左侧CCA的近端及远端，并从中间剪断，以彻底阻断CCA血流，连续3 d庆大霉素肌肉注射，预防感染，最后逐层缝合皮下结缔组织、皮肤。1 w后再结扎右侧CCA，操作方法同第1次。假手术组仅分离暴露双侧CCA而不结扎。

1.4.2给药及取材方法 归芪聪志汤按高、中、低剂量灌胃给药，阳性对照组给予吡拉西坦，假手术组、模型组给予等量生理盐水，剂量1.5 ml/100 g，1次/d，连续灌胃治疗28 d。大鼠麻醉后经心脏灌注内固定取脑，取大鼠脑最宽部位(海马冠状位)约4 mm。

1.4.3动物模型成功的判断 术后7 d行Morris水迷宫实验，连续训练5 d，每次2 min，第3天开始记录，取假手术组大鼠逃避潜伏期的均值为参考值，同时计算模型组大鼠平均逃避潜伏期与参考值之差占该鼠的平均逃避潜伏期的比值，该值>20%定为痴呆鼠〔4〕。

1.4.4大鼠学习记忆能力测试 Morris水迷宫实验：第1天让大鼠自由游泳120 s。第2天开始正式对大鼠进行Morris水迷宫测试。将大鼠面向池壁放入水中，每天测试1次，每只每次测试120 s，连续5 d，记录大鼠寻找并爬上平台所需时间(逃避潜伏期)。在测试第6天，撤除水下平台，让大鼠在无平台情况下寻找记忆平台。随机选取一入水点，将大鼠面向池壁放入水中，每只大鼠限时游120 s，记录其在120 s内游过原平台相应位置的次数。

1.4.5病理组织学检查 每组随机抽取6只大鼠的海马进行石蜡切片，常规脱蜡、乙醇梯度脱水、苏木素-伊红染色，二甲苯透明，中性树胶封片。应用SP法进行免疫组织化学染色，严格按照试剂盒说明进行操作。其中兔抗VEGF、HIF-1α、HO-1的工作浓度分别为1∶100、1∶200、1∶100。光镜下观察结果，细胞质、胞核染成棕黄色或棕褐色为阳性细胞。每张片子在400倍下随机选5个视野，计数每个视野下的阳性细胞数目，取平均值，各组免疫组化结果应用Leica Qwin病理图像分析系统处理。

1.4.6实时荧光定量PCR 将冻存的大鼠海马组织进行称重，50～100 mg，加200 μl的Trizol液，研磨充分后再加入剩下的800 μl Trizol液，混匀，室温放置5 min；4℃，12 000 r/min，离心5 min，吸出上清液到新的EP管，加入200 μl氯仿，用力震荡15 s，放置3 min；4℃，12 000 r/min，离心15 min，取上清液加500 μl异丙醇，混匀，放置10 min，4℃，12 000 r/min，离心10 min，弃去上清液；用75%的乙醇清洗沉淀2次，4℃，7 500 r/min，离心5 min，风干后用DEPC水溶解，并测OD值；分装后-80℃保存。逆转录反应严格按照试剂盒说明书进行操作，布板，然后利用荧光定量PCR软件进行分析，观察扩增曲线。

1.5统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1各组学习记忆能力比较 与假手术组比较，模型组逃避潜伏期明显延长，跨原平台次数明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，归芪聪志汤中剂量组、阳性对照组大鼠逃避潜伏期明显缩短，跨原平台次数明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)，其中归芪聪志汤中剂量组明显优于阳性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组逃避潜伏期、跨原平台次数比较

与假手术组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与阳性对照组比较：3)P<0.05，下表同

图1 各组海马神经元形态结构(HE，×400)

2.2各组海马神经元形态结果比较 见图1。假手术组海马区组织结构完整，神经元数目和形态正常，排列整齐，神经元树突正常，分支较多，细胞核大而圆，核仁清晰，HE染色均匀。模型组海马区神经元大部分变性坏死，数目显著减少，排列紊乱，神经元树突大量缺失，分支较少，细胞核固缩、深染，核仁消失。与模型组相比，归芪聪志汤各剂量组和阳性对照组神经元损伤减轻，神经元数目及其树突增多，细胞核固缩现象减轻，其中归芪聪志汤中剂量组和阳性对照组较归芪聪志汤高、低剂量组神经元更加完整。

2.3各组海马组织HIF-1α、VEGF、HO-1蛋白表达比较 与假手术组比较，模型组HIF-1α、VEGF和HO-1的阳性细胞数表达均明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，各治疗组HIF-1α、VEGF和HO-1的阳性细胞数表达均增多，其中归芪聪志汤中剂量组、阳性对照组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，归芪聪志汤中剂量组HIF-1α、VEGF和HO-1的阳性细胞数表达均显著增多，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2，图2、图3、图4。

表2 各组海马组织HIF-1α、VEGF、HO-1蛋白表达比较(每高倍镜下阳性细胞个数，

图2 各组海马组织HIF-1α蛋白表达比较(DAB，×400)

图3 各组海马组织VEGF蛋白表达比较(DAB，×400)

图4 各组海马组织HO-1蛋白表达比较(DAB，×400)

2.4各组海马组织HIF-1α、VEGF、HO-1 mRNA表达比较 与假手术组比较，模型组HIF-1α、VEGF、HO-1 mRNA表达量均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，归芪聪志汤高剂量组与阳性对照组HIF-1α、VEGF、HO-1 mRNA表达量均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 各组海马组织HIF-1α、VEGF、HO-1 mRNA表达比较

3 讨 论

脑血管疾病导致的脑组织缺血缺氧是VD的主要病因〔5〕。低氧环境下，机体会产生一系列适应反应以维持氧稳态，而HIF-1是氧分压的主传感器，其中HIF-1α是直接感受缺氧的感受器〔6〕。HIF-1α通过调控靶基因的表达激活相关信号通路使机体对缺氧的耐受及维持体内稳态方面发挥着重要作用。目前已知的受HIF-1α调控的靶基因有130余种，其中对VEGF的调控尤为重要〔7〕，VEGF是由细胞产生的能刺激新生血管形成的化学因子，而血管生成又保护了残存的神经细胞，并对学习记忆相关的要害部位皮层、海马、小脑的各种神经细胞发挥直接的神经营养性效应和神经再生作用〔8〕。Manoonkitiwongsa等〔9〕还发现VEGF具有独立于血管形成之外的神经保护作用。另外，HIF-1α的靶基因HO-1是血红素分解代谢过程中的限速酶，它可以使血红素分解代谢产生一氧化碳(CO)、胆绿素(迅速转变为胆红素和游离铁)、铁结合蛋白〔10〕，适量的CO在存在于脑组织中，能使血管扩张、抑制血小板的聚集、减少脂质过氧化和蛋白质氧化，从而发挥其细胞保护作用，而生理浓度范围内的胆红素和胆绿素是体内强有力的抗氧化剂〔11〕，并有研究发现海马注射重组腺相关病毒介导HO-1基因，可增加慢性缺血大鼠海马组织超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛、一氧化氮含量，减少氧化应激损伤〔12〕。本研究表明归芪聪志汤治疗VD的机制可能与促进HIF-1α、VEGF、HO-1的表达相关，也可能与促进HIF-1α的表达，从而激活其靶基因VEGF、HO-1，最终激发脑内的神经修复机制相关。

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7Higashida T，Kreipke CW，Rafols JA，etal.The role of hypoxia-inducible factor-1a，aquaporin-4 and matrix metalloproteinase-9 in blood-brain barrier disruption and brain edema after traumatic brain injury：laboratory investigation〔J〕.J Neurosurg，2011；114(1)：92-101.

8Zhang N，Xing M，Wang Y，etal.Hydroxysafflor yellow a improves learning and memory in a rat model of vascular dementia by increasing VEGF and NR1 in the hippocampus〔J〕.Neurosci Bull，2014；30(3)：417-24.

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