两种不同方法建立乳鼠神经细胞缺氧/复氧损伤模型

刘 威 王 爽 温 娜 王洪羽 万晓明 金 宏

(吉林医药学院临床技能实验室，吉林 吉林 132001)

目前缺血缺氧性脑病基本治疗原则是恢复血流再通，常用的治疗方法有溶栓、介入等〔1〕。但缺氧的脑组织在恢复血流灌注的同时却往往损伤程度加重，形成缺氧/复氧损伤，这是临床上最常见的脑血管疾病的病理过程之一，可导致神经细胞的直接或间接死亡，对患者预后产生不良影响，使其生活质量下降。目前利用药物减轻氧化应激反应的研究成为热点，建立简便、稳定的神经细胞缺氧/复氧损伤模型是开展药物研究的前提。本实验采用两种常见的导致细胞氧化损伤药物：过氧化氢(H2O2)和氯化钴(CoCl2)，分别作用于乳鼠原代提取神经细胞，分析其在建立缺氧/复氧损伤模型方面的应用价值。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 DMEMF12培养液为美国Gibco公司产品；MTT、胰蛋白酶为美国Sigma公司产品；新生牛血清为四季青公司产品；二氧化碳培养箱购自日本SANYO公司。

1.2细胞培养 取新生72 h内的SD大鼠乳鼠3～4只，剪取脑组织，冰面上平皿中磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，置于大离心管中剪碎，PBS液冲洗2次，以0.25%胰蛋白酶反复消化，直至组织块消失。收集液以200目滤网过滤，离心重悬后调整密度为105～106ml-1接种于细胞培养板中，96孔板每孔200 μl。

1.3实验分组及浓度处理 待细胞贴壁生长良好时分组，空白组无处理因素继续培养，H2O2组加入H2O2终浓度为200、400、600、800、1 000 μmol/L的培养基，分别培养50 min、2 h、3 h后换正常培养基继续培养18 h，不同浓度不同时间设3个复孔。CoCl2组分别加入CoCl2终浓度为100、200、300、400、500 μmol/L的无血清培养基，每个浓度设5个复孔，培养20 h后换正常培养液继续培养24 h。

1.4MTT法检测细胞存活率 培养结束后各组神经细胞以PBS清洗2次，加入无血清培养液及20 μl MTT溶液，37℃培养4 h。弃上清后每孔加入150 μl二甲基亚砜，震板10 min，酶标仪490 nm处测定吸光度(A)值，计算细胞存活率。

1.5统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行方差分析和配对t检验。

2 结 果

2.1H2O2致大鼠乳鼠神经细胞缺氧/复氧损伤结果 H2O2引起神经细胞缺氧/复氧损伤程度与剂量和时间呈正比，剂量越大，处理时间越长，细胞的损伤越明显，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。其中600、800 μmol/L作用于神经细胞缺氧3 h，复氧24 h效果较好，细胞存活率在50%～60%，宜选择该浓度和时间建立缺氧/复氧损伤模型。

表1 不同浓度H2O2作用不同时间对神经细胞存活率的影响

与空白组比较：1)P<0.05

2.2不同浓度CoCl2致大鼠乳鼠神经细胞缺氧复氧损伤结果 不同浓度 CoCl2作用于神经细胞24 h可导致细胞存活率明显下降，与空白组〔(100.00±0.00)%〕相比差异有统计学意义(P<0.05)，其损伤程度随CoCl2浓度增加而增强，100、200、300、400、500 μmol/L时，细胞存活率分别为(84.56±3.17)%、(80.29±41.02)%、(59.78±2.69)%、(51.59±3.06)%、(34.66±2.32)%,其中300、400 μmol/L作用24 h效果较好，可选择该浓度造模。

3 讨 论

缺血缺氧性脑病是临床上常见的一种疾病，各种脑血管意外是其常见病因，减轻治疗过程中产生的缺血再灌注损伤成为近年来成为研究的热点。目前研究多采用体外培养细胞作为实验对象，利用物理或化学方法建立缺氧损伤模型。物理方法多是利用含有氮气的三气培养箱，或利用氮气密封体外培养细胞，造价昂贵，操作复杂，效果不稳定。相比之下利用化学药物诱导细胞缺氧简便易行，重现性好。本研究采用了两种常用的氧化剂H2O2和 CoCl2作用于乳鼠神经细胞引起细胞氧化损伤。细胞的氧化损伤主要是由反应活性氧(ROS)引起的，它介导的氧化应激损伤与各种心脑血管疾病的发生和发展有关〔2〕。ROS种类多样，H2O2是其中一种主要形式，它易于穿过细胞膜，在短期内引发细胞产生各种ROS；ROS在细胞内积聚，迅速引起细胞内物质过氧化，细胞功能紊乱，膜通透性增加甚至死亡〔3〕。本研究表明H2O2对细胞作用迅速，诱导缺氧效果显著，该效果在一定范围内与浓度呈正比。与H2O2相CoCl2作用神经细胞后往往引起缺氧过程较缓慢，有研究表明〔4〕利用CoCl2建立的鼠脑缺氧模型可用于研究细胞内相关酶，蛋白及细胞因子在缺氧损伤过程中的作用机制，其机制主要是Co2+可进入细胞并置换催化酶上的Fe2+导致酶失效〔5〕。另外也可使抑制引起细胞缺氧损伤的缺氧诱导因子(HIF)-1降解，从而诱发细胞缺氧损伤〔6〕。这些研究表明Co2+在造模机制上更符合慢性缺氧的特点，不仅仅可以成功模拟缺氧状态，还可以模拟缺氧的病理过程。本研究表明CoCl2可诱导原代提取神经细胞的缺氧损伤，其严重程度与浓度在一定范围内呈正比。总之，H2O2和CoCl2这两种氧化剂均可导致细胞氧化损伤，效果确切，且实验模型易于建立，重复性好，但诱导细胞缺氧时间不同，可根据实验要求选择其中一种造模，以研究药物对缺氧性疾病的作用机制。

1Roger VL,Go AS,Llo YD JM,etal.Heart disease and stroke statistics-2011 update:a report from the American Heart Association〔J〕.Circulation,2011;123(4):e18-e29.

2Nourazarian AR,Kangari P,Salmaninejad A.Roles oxidative stress in the development and progression of breast cancer〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2014;15(12):4745-51.

3陈刚领,郑建普,李亚娟.H2O2氧化损伤血管内皮模型的构建及超氧化物歧化酶对损伤的逆转作用〔J〕.中国药理学通报,2009;25(7):884-7.

4Rani A,Prasad S.CoCl2induced biochemical hypoxia down regulates activities and expression of super oxide dismutase and catalase in cerebral cortex of mice〔J〕.Neurochem Res,2014;39:1787-96.

5Ohtomo S,Nangaku M,Lzuhara Y,etal.Cobalt ameliorates renal injury in an obese hypertensive type 2 diabetes rat model〔J〕.Nephrol Dial Transplant,2008;23(4):1166-72.

6Gilkes DM，Semenza GL,Wirtz D.Hypoxia and the extracellular matrix:drivers of tumour metastasis〔J〕.Nat Rev Cancer,2014;14(6):430-9.