miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1在人骨肉瘤中表达及临床价值

刘 洋 董 平 郗 政 邓志会 沈洪涛 张 彦 杨普程

(齐齐哈尔医学院附属第二医院骨外科，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

骨肉瘤(OS)是来源于间叶组织常见原发恶性肿瘤，OS在每个年龄段均有发病，超过3/4患者为青少年，约1/4为老年患者，且男性多于女性〔1〕。OS容易发生血行转移，5年生存率较低，约为20%。临床的主要治疗为手术联合辅助化疗，但疗效不甚明显，OS生存率提高到不足50%〔2〕。OS病变复杂，尚无一个完整体系概括，但病变多在癌细胞侵袭、转移和自噬等方面，报道显示，miR-195属于微小RNA(miR)-15/16/195家族，在肝癌、结肠癌和非小细胞等多种恶性肿瘤中异常表达，参与癌细胞侵袭与转移〔3〕；核糖体蛋白L34是核糖体蛋白 L34E家族成员，参与胃癌等恶性肿瘤细胞的增殖和抗凋亡过程〔4〕；自噬参与肿瘤细胞凋亡、耐药及肿瘤干细胞分化增殖的调节，Beclin1作为重要的自噬相关因子，在自噬体形成过程扮演重要角色〔5〕。miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1是恶性肿瘤病变中研究较多的标记物。本研究拟分析人OS miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 2010年4月至2012年6月齐齐哈尔医学院附属第二医院确诊为OS的患者56例，年龄60～72岁。病变部位为股骨20例、肱骨15例、胫骨15例和腓骨6例。均接受常规化疗联合手术，手术为单纯肿瘤切除术或关节置换术，手术前后均接受常规化疗。选择同期骨软骨瘤患者35例，两组一般临床资料差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组一般情况比较

1.2排除标准 术前接受辅助治疗；诊断时已出现癌转移；预计存活时间≤6个月；存在精神障碍，不配合研究或资料不完整者。

1.3免疫组织化学染色检测miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1的表达 石蜡切片常规脱蜡和水化，枸橼酸缓冲液热修复抗原，冷却至室温以磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，滴加 3%过氧化氢行过氧化物酶阻断，PBS冲洗，滴加山羊血清封闭，去除封闭液，滴加一抗鼠抗人miR-195(1∶100)、核糖体蛋白L34(1∶20 )和兔抗人Beclin1(1∶200)，4℃孵育过夜，37℃复温45 min，PBS冲洗，分别滴加抗鼠、生物素化和抗兔二抗(37℃孵育1.0 h)、PBS冲洗，二氨基联苯胺(DAB)显色，Mayer苏木素复染，脱水，透明及封片，PBS缓冲液替代一抗作为对照。阳性及半定量判断采用双盲法由两位病理科医生独立审阅所有切片。判断标准：每个视野计数 100 个细胞，依据阳性细胞的比率及染色度进行判定。①阳性细胞比例评分：阳性细胞数/总细胞数<10%为0分；阳性细胞数/总细胞数10%～25%为1分；阳性细胞数/总细胞数26%～50%为2分；阳性细胞数/总细胞数>50%为3分。②染色深度评分：无染色为0分；淡黄色为1分，黄色至棕黄色为2分；深黄色至深棕黄色为3分。③总积分=阳性细胞比例评分+染色深度评分：0 分阴性(-)，≥1分阳性(+)。采用Microdensitometer对染色切片进行定量，每张切片测试5个区域，计算每个区域抗原的百分比，求均值，以每批切片的阴性对照调零，并对玻片校正厚度，消除玻片厚度对结果的影响。

1.4细胞坏死率为化疗效果的判断依据 化疗前活检标本和术后切除的瘤体均行HE染色，每张切片随机取5个视野，计数存活的肿瘤细胞。肿瘤细胞坏死率=(化疗前细胞数-化疗后细胞数)/化疗前细胞数×100%。细胞坏死率≥90%为化疗效果良好，<90%为化疗效果不佳。

1.5生存分析 完成最后一次化疗作为随访时间起点，以复诊、电话、微信和E-mail方式记录所有患者出现复发、肿瘤转移及死亡的病例。

1.6统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行t、χ2检验，相关性行Spearman分析，生存率采用Log-rank检验。

2 结 果

2.1两组miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1表达 miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1分别在细胞质及细胞核表达。与骨软骨瘤组比，OS组miR-195和Beclin1阳性或半定量表达明显降低(P<0.001)，核糖体蛋白L34阳性或半定量表达明显增高(P<0.001)，见表2、表3和图1。

表2 两组miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1阳性表达〔n(%)〕

表3 两组miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1半定量表达

图1 两组miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1表达(DAB，×200)

2.2OS组miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1相关性 miR-195与核糖体蛋白L34和Beclin1分别呈负和正相关(r=-0.64,0.68,均P<0.05)，核糖体蛋白L34和Beclin1呈正相关(r=0.72,P<0.05)。

2.3miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1表达与化疗效果的关系 miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1表达呈阴性、阳性及阴性者化疗效果不佳，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

2.4miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1表达与5年生存时间的关系 OS组均获得5年随访，存活26例(46.43%)，死亡30例(53.57%)，转移16例、复发12例、交通意外死亡1例、不明原因死亡1例。 miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1表达分别为阳性、阴性和阳性的患者5年生存时间均显著较长(χ2=4.207,P=0.040；χ2=4.033,P=0.045；χ2=4.858,P=0.028)，见图2。

图2 OS组miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1表达与5年生存时间

表4 OS组miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1表达与化疗效果的关系〔n(%)〕

3 讨 论

miR-195是基因转录后调控的非编码小分子RNA，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡及肿瘤发生等多种病理过程〔6〕。本课题结果提示miR-195在人OS病变中起保护作用，检测癌组织miR-195表达可评估患者预后。研究显示〔7～11〕，miR-195在结肠癌组织中的表达水平减少与结肠癌患者低生存率有明显相关性，与miR-195具有抑制结肠癌癌细胞侵袭及迁移相关；原位杂交显示miR-195在转移前列腺癌组织中的表达显著低于非转移前列腺癌组织，在前列腺癌细胞中高表达的miR-195能够抑制细胞的迁移和侵袭能力,同时上皮间质转化常见标识蛋白波形蛋白及N-钙黏素水平降低。miR195可作为靶向调控的化疗干预。

核糖体蛋白L34 是一种保守的核糖体蛋白，在恶性肿瘤中均表现出核糖体外功能〔4,12,13〕，如人胃癌细胞株 SGC-7901 的核糖体蛋白L34 表达敲减可增加细胞凋亡，抑制细胞增殖，迫使细胞分裂周期阻滞在 S 期，核糖体蛋白L34 高表达可促进非小细胞肺癌细胞株H1299增殖，且在非小细胞肺癌组织呈现过表达，核糖体蛋白L34 在人胰腺癌组织和胰腺癌细胞株中过表达，参与抑癌基因 RPL34基因启动子的甲基化过程，该过程降低了RPL34基因的抑癌作用。敲除核糖体蛋白L34可有效抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和耐药性，致使胰腺癌细胞停滞于G2 期进而凋亡，可见核糖体蛋白L34参与癌细胞的增殖、周期及抗凋亡过程，上述作用可能与核糖体蛋白34 表达改变丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/p53 信号通路活性相关，MAPK/p53 信号有助于调控癌细胞的增殖及转移〔14〕。本课题结果显示核糖体蛋白L34在人OS呈高表达，参与人OS的发生发展过程。

Beclin1参与肿瘤细胞自噬，在肿瘤发生发展中发挥抑瘤和促瘤双重作用〔5,15〕。一方面，Beclin1可通过增强肿瘤细胞的自噬活性，诱导肿瘤细胞自噬性凋亡，抑制肿瘤的发展。该作用较典型地表现在肝癌、卵巢癌和前列腺癌等恶性肿瘤中， Beclin1基因缺失或突变，Beclin1表达也呈下调状态〔16,17〕。另一方面，Beclin1 可通过 PI3K 通路形成自噬复合物，抑制下游信号通路p53，抑制细胞凋亡，促进肿瘤发展，例如在胃癌和肺癌的表达是上调的，随着肿瘤级别的增高而表达增高〔18〕。本课题Beclin1 阳性表达的OS患者5年生存率明显高于阴性表达的患者，以往也有类似报道〔19〕，而且Beclin1 阳性表达的患者化疗效果较好，差异无统计学意义，可能与纳入案例较少有关。离体研究也显示，Beclin1基因过表达可以激活人OS MG63细胞株的凋亡，抑制其增殖〔18〕。可见人OS中Beclin1依赖的肿瘤自噬表现出抑瘤机制，增强机体的依赖Beclin1 型肿瘤自噬有助于治疗肿瘤，改善患者生存状态。

综上，人OS患者miR-195、核糖体蛋白L34和Beclin1表达水平与预后密切相关，miR-195和Beclin1表达水平越高，核糖体蛋白L34表达越低，预后较好。

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