吴茱萸次碱通过SIRT1通路干预氧化应激诱导血管平滑肌细胞增殖的作用

马 懿 吴赛珠 阮云军 苏 双

(遵义医学院附属医院，贵州 遵义 563000)

氧化应激损伤是心血管疾病重要的致病因素，在动脉粥样硬化(AS)形成与粥样斑块破裂的过程中，血管内皮细胞和平滑肌细胞的结构与功能会发生一系列的改变〔1〕。吴茱萸次碱是芸香科植物吴茱萸中一种重要生物活性碱，主要存在于吴茱萸及同属植物石虎的果实、根茎等部位中，在传统中医药中广泛使用〔2〕。其除具有抗炎、抑制癌基因、抗缺血等药理学效应外，还有抑制血小板聚集的心血管保护作用〔3〕。沉默信息调节因子(SIRT)1是真核细胞生物普遍表达的去乙酰化蛋白，通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)协同去乙酰化反应，可增加胞内NAD含量从而提高SIRT1的活性〔4〕。研究发现，SIRT1能调控机体细胞新陈代谢，维持血管内皮细胞周期稳态，抑制氧化应激诱导的细胞衰老与凋亡，可作为哺乳动物的一种长寿预测因子〔5〕。本研究旨在观察吴茱萸次碱在氧化应激下发挥抗细胞增殖的效应作用，并探讨与SIRT1的初步联系。

1 材料和方法

1.1细胞原代与传代培养 实验用3月龄雄性Wistar大鼠由南方医科大学实验动物中心提供。无菌超净台分离胸主动脉，去除外膜沿血管轴纵行剪开血管刮去内皮剪成碎片，平铺于培养瓶上，加入15%胎牛血清培养液，置于含5%CO237℃电热恒温孵育箱，2～3 h后翻瓶培养，每2～3天换液1次，视细胞密度以1∶2～1∶3比例分瓶培养，待细胞在培养瓶形成致密单层时即可传代。

1.2实验分组 取传至4～6代血管平滑肌细胞(VSMCs)，以2×104个/ml的细胞数接种于96孔板，每孔100 μl。实验分组：①空白组：仅加入培养基；②叔丁基过氧化氢(t-BHp)组：80 μmol/L t-BHp处理细胞24 h；③吴茱萸次碱组：10 μmol/L吴茱萸次碱预处理2 h后，再加入80 μmol/L t-BHp处理24 h；④EX-527组：10 μmol/L EX-527预处理细胞2 h〔6〕，其余处理同吴茱萸次碱组。每组设5个平行对照。

1.3主要试剂 吴茱萸次碱(纯度>98%)购于中国国家药品与生物制品研究所；t-BHp、EX-527购于美国Sigma公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；SIRT1一抗购于美国Cell Signaling Technology公司；二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)荧光探针由美国Invitrogen生物技术公司提供；缩胆囊素八肽(CCK-8)试剂盒与辣根过氧化物酶标记羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4细胞增殖率检测 将干预终点细胞在96孔板，加入100 μl CCK-8工作液，置于37℃恒温箱孵育过夜，次日避光采用酶标仪检测各细胞标本450 nm处的吸光度值。

1.5MDA、SOD与活性氧(ROS)水平检测 RIPA裂解液裂解细胞后，使用BCA试剂盒蛋白定量。MDA采用硫代巴比妥酸法，SOD采用水溶性四氮唑(WST-1)法，严格按试剂盒说明书操作。将DCFH-DA荧光染料用无血清培养基稀释成工作液浓度10 μmol/L，培养基洗涤细胞后直接加入DCFH-DA，在CO2培养箱37℃下避光孵育细胞1 h。孵育结束后用培养基洗涤细胞去除胞外荧光物质，检测荧光强度。DCFH-DA的激发波长和发射波长分别为488 nm和525 nm。绿色荧光与细胞内ROS水平呈正相关，强度表示ROS浓度水平。

1.6real-time PCR法检测SIRT1 mRNA表达 使用Trizol裂解细胞提取总RNA、经异丙醇沉淀及乙醇洗涤后，用微量分光光度计定量，A(260)/A(280)及总RNA浓度。各组分别取2 μg总RNA，使用DEPC水溶解，在PCR仪中进行逆转录反应，收集逆转录获得cDNA产物置于-20℃保存。采用real-time PCR仪进行实时定量PCR反应。qPCR反应体系包括：cDNA 4 μl、2×SYBR Master Mix 12.5 μl、引物各1 μl、Taq酶0.15 μl、三蒸水6.35 μl。各基因的引物分别为：SIRT1 正义链5'-ACA ACC TCC TGT TGG CTG ATG AGA-3' 反义链5'-AGA ATT GTT CGA GGA TCG GTG CCA-3'；β-actin 正义链5'-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3' 反义链5'-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3'。SIRT1 mRNA表达量是与β-actin表达比值的相对值。

1.7Western印迹法检测SIRT1蛋白表达 各取80 μg蛋白煮沸5 min，进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后电转移至0.45 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在含5%脱脂奶粉封闭液(pH7.5，Tris-HCl 10 mmol/L，NaCl 50 mmol/L，0.1% Tween 20)中室温封闭2 h，加一抗(1∶1 000)4℃孵育过夜，次日取出PVDF膜用TBST摇床洗膜10 min×3次，按1∶5 000稀释羊抗兔生物素标记二抗室温下摇床孵育，再次洗膜3次，然后电化学发光(ECL)底物化学显色，上机扫描储存图像。采用Image J软件进行条带定量分析。

1.8统计学分析 应用SPSS16.0软件进行分析，组间比较方差齐时用单向方差分析LSD法检验，方差不齐时采用DunnettT3检验。

2 结 果

2.1各组SOD、MDA含量及ROS水平比较 与空白组比较，t-BHP组SOD含量显著降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)，ROS水平显著升高(P<0.05)；与t-BHp组比较，吴茱萸次碱组SOD含量明显增高(P<0.05)，而MDA含量显著下降(P<0.05)，ROS水平显著降低(P<0.05)；与吴茱萸次碱组比较，EX-527组SOD含量显著下降(P<0.05)，MDA含量明显升高(P<0.05)，ROS水平显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组MDA、SOD含量及ROS水平比较

与空白组比较：1)P<0.05；与t-BHp组比较：2)P<0.05；与吴茱萸次碱组比较：3)P<0.05，下表同

2.2各组SIRT1 mRNA与蛋白的表达 与空白组比较，SIRT1 mRNA与蛋白在t-BHp组中的表达显著减少(P<0.05)；吴茱萸次碱组SIRT1 mRNA与蛋白的表达显著高于t-BHp组(P<0.05)；与吴茱萸次碱组比较，EX-527组SIRT1 mRNA与蛋白的表达显著下降(P<0.05)，见图1、表2。

图1 Western 印迹检测各组细胞中SIRT1蛋白表达

组别SIRT1mRNASIRT1蛋白空白组1．09±0．060．69±0．05t⁃BHp组0．40±0．121)0．28±0．041)吴茱萸次碱组0．87±0．092)0．43±0．082)EX⁃527组0．57±0．073)0．32±0．063)

3 讨 论

AS是中老年人群易患的心血管疾病，其主要特点是动脉管腔的硬化与狭窄，管壁舒张顺应性减退，尤其在硬化基础上形成粥样斑块后，脂质代谢障碍，管壁主要构成细胞内皮细胞与平滑肌细胞在生物功能和形态结构上出现病理生理改变，如内皮细胞损伤、VSMCs增殖能力失调等〔7〕。AS进程中的氧自由基产生与血管腔出现的相关病理生理改变之间存在密切联系。随AS斑块进展，大鼠主动脉的氧化应激程度与ROS增加〔8〕，过量生成的ROS会引起血管内皮细胞功能与平滑肌细胞增殖代谢能力异常，细胞抗氧化损伤能力减退促进了冠状动脉疾病的发生。

有研究发现，VSMCs在不同的疾病环境中的作用不同，在自由基诱导下通过收缩表型向巨噬样表型转变，能占据修饰的低密度脂蛋白、游离胆固醇和凋亡细胞而促进粥样斑块形成；而在动脉粥样进展期，可转化为分泌型表型，具备高增殖能力，抑制氧自由基与氧化性低密度脂蛋白对斑块的影响，促进细胞外基质产生，这样能增加斑块稳定性，阻碍斑块破裂和AS血栓形成〔9〕。AS演变与一系列氧化应激损伤与ROS等自由基大量产生密切相关。而细胞内这些ROS的重要部分如O2-和H2O2的来源包括了线粒体电子传递链、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶、过氧化物酶和细胞色素P450系统〔10〕。在VSMCs中ROS能够促进氧化应激的二次产物如多不饱和脂肪酸、自由醛和生物核心醛等氧化脂质同时参与到自由基的激活过程中。这些活性脂质聚集在病变血管VSMCs中激活高度亲电子产物，如丙烯醛、4-羟基壬烯醛(HNE)和POVPC的释放，增加VSMC的增殖、表型转换或凋亡〔11〕。

有研究发现，吴茱萸次碱具有广泛的药理学效应，如延缓心肌重塑、抗血栓和AS等心血管保护作用，这些作用可能与下调NADPH氧化酶活性，减少ROS产生密切相关〔12〕。而通过吴茱萸次碱的干预可以抑制单核细胞迁移及抑制趋化因子受体(CCR)2、细胞间黏附分子(ICAM)-1，通过促进磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表达，下调膜Fasl表达从而削弱肾素-血管紧张素系统对血管的影响〔13〕，这些在AS的演变中均发挥关键作用。

SIRT1是真核生物细胞内普遍表达的去乙酰化蛋白，它能调控细胞周期，改善机体代谢，延缓细胞衰老与凋亡。由于氧化还原激活受到NAD+组蛋白去乙酰化、转录因子和辅助激活因子如p53、FOXO、核转录因子(NF)-κB、过氧化物酶体增殖活化受体P共激活因子(PGC)-1α和Ku70的调控〔14〕，SIRT1可能是氧化还原调控的操作者。氧化应激在调控SIRT1去乙酰化活性中发挥显著作用〔15〕。研究表明，SIRT1通过抑制p53依赖的凋亡在氧化应激状态促进细胞生存，通过去乙酰化抑制p53反式激活。过氧化氢处理能上调SIRT1表达和过氧化氢酶的诱导〔16〕。SIRT1和FOXO3绑定共同应对氧化应激，SIRT1介导的SOD，通过去乙酰化和激活FOXO3转录因子〔17〕。SIRT1过表达和特定的药物激活剂(SRT1720)减少了RelA/p65乙酰化和NF-κB依赖炎症诱导的氧化应激状态〔18〕。在氧化应激状态SIRT1数量减少和活性减低可能导致NF-κB 与FOXO3的乙酰化增加。

本研究结果显示，通过吴茱萸次碱处理后，能明显削弱t-BHp诱导VSMCs的SIRT1 mRNA和蛋白表达下降的情况。而反映氧化应激程度的特征性物质MDA含量与ROS水平通过吴茱萸次碱处理明显下降。另外在实验中加入SIRT1抑制剂EX-527，上述吴茱萸次碱所表现出来的抗氧化损伤能力、上调SIRT1蛋白表达，改善细胞中SOD含量的保护性作用均被不同程度的抑制。在吴茱萸次碱抑制t-BHp诱导的VSMCs氧化应激损伤中，SIRT1信号通路可能发挥重要作用。

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