浸润性肺腺癌术后组织中跨膜蛋白-1及其受体和基质金属蛋白酶-9表达及关系

周 亮 陈其玖 张建勇 刘 波 马 龙

(遵义医学院附属医院呼吸科，贵州 遵义 563000)

肺癌病变常由肺泡上皮的不典型增生及原位腺癌转变而来，形成浸润性腺癌后病变进展迅速〔1〕。跨膜蛋白(PD)-1是Ⅰ型跨膜糖蛋白，PD-L1是其配体，有共刺激性和共抑制性，肿瘤细胞高表达PD-L1，与PD-1结合后，激活PD-1/PD-L1 信号系统，抑制细胞毒性T淋巴细胞的活性，使T淋巴细胞阻滞在G0/G1期，阻碍其分化为浆细胞，从而引起T淋巴细胞发生凋亡，激活肿瘤细胞的免疫逃逸，促进肿瘤的发生和发展〔2〕。基质金属蛋白酶(MMP)-9不仅是调节细胞外基质降解的蛋白，还对肿瘤的血管生成、肿瘤的间质侵犯起明显促进作用〔3〕。本实验检测浸润性肺腺癌术后组织中PD-1、PD-L1和MMP-9的半定量表达，探讨其临床价值。

1 资料与方法

1.1临床资料 2014年1月至2016年12月遵义医学院附属医院经病理医师确诊为浸润性肺腺癌的患者75例为观察组，均行根治手术，术后留取新鲜的肿瘤标本，置于70%的酒精中保存。年龄50～87岁，平均66.8岁。排除标准：①多原发癌；②有肺部手术史；③伴有其他严重内脏器官疾病。其中有转移19例，无转移56例。选择上述患者中距肿物边缘>3 cm的36例正常肺组织为对照组，年龄52～83岁，平均64.3岁，其中男20例，女16例。标本留取方法同上。两组在一般资料差异无统计学意义。

1.2PD-1、PD-L1和MMP-9蛋白的检测 将术后应用酒精固定的组织取出，用眼科剪子剪成粉末状，置于铜网上轻搓，用0.9%的盐水冲洗后，再次过滤。离心，将组织制备成单细胞悬液。每次检测均取1 ml单细胞悬液后加入一抗、磷酸盐缓冲液(PBS)及异硫氰酸荧光素(FITC)-IgG二抗，均严格操作方法，应用美国BC公司生产的Epics-XLⅡ型流式细胞仪，应用系统自带的软件(Expo 32 ADC)进行数据分析。

1.3结果判定 应用荧光指数(FI)为结果表达值。FI=(肿瘤中蛋白表达的荧光强度-对照样品平均荧光强度)/正常对照样品平均荧光强度。

1.4统计学方法 应用SAS6.12统计软件进行t检验，方差分析，线性相关分析。

2 结 果

2.1PD-1、PD-L1和MMP-9在两组中的表达 PD-1、PD-L1和MMP-9在观察组中表达量明显高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 PD-1、PD-L1和MMP-9在两组中表达

2.2PD-1、PD-L1和MMP-9的表达在观察组不同临床病理特征中的比较 PD-1、PD-L1和MMP-9的表达量均与肿瘤最大径和增殖指数有关，MMP-9的表达量与淋巴结转移有关，三者均与肿瘤的性别、年龄无关。见表2。

2.3观察组PD-1、PD-L1和MMP-9的相关性 PD-1和MMP-9、PD-L1和MMP-9的表达均无明显相关性(P>0.05)。

表2 PD-1、PD-L1和MMP-9的表达在观察组不同临床病理特征中的比较

3 讨 论

浸润性肺腺癌常见类型有腺泡型、乳头型、黏液型、非黏液型、胎儿型、透明细胞型等〔4〕。肿瘤细胞间质中可见到以淋巴细胞为主的炎细胞浸润。淋巴细胞作为肿瘤间质微环境中的重要成分，参与肿瘤的进展及免疫性微环境的形成过程。机体对抗肿瘤细胞重要的是细胞免疫，T淋巴细胞是重要角色，T淋巴细胞能抑制或杀灭肿瘤细胞〔5〕。T淋巴细胞激活需要两个信号的协同作用：T淋巴细胞激发的第一信号是T淋巴细胞受体识别主要组织相容性复合体(MHC)-抗原复合物，即T淋巴细胞对抗原的特异性识别；第二信号是抗原递呈细胞(APC)所表达的共刺激分子与T细胞所表达的共刺激分子受体结合，传递的共刺激信号〔6〕。PD-1是一种50～55 kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白，是B7-CD28家族成员，主要以细胞表面受体形式表达于T细胞、B细胞、单核细胞及自然杀伤细胞，目前其有PD-L1和PD-L2两个配体，主要表达于APC上，其作用主要是抑制信号传递到T细胞受体。也有研究认为其可以增加P15的表达同时抑制细胞周期调控因子细胞S期激酶相关蛋白(SKP)2转录，使细胞停滞于G1期〔7〕。研究显示PD-1通路参与慢性感染的免疫性调节，高表达时可以耗尽持续活化的T细胞，使T细胞丧失增殖和消灭侵入机体的微生物的功能，使感染持续存在。丧失活性的T细胞可以减少机体免疫性的损伤〔8〕。在肿瘤细胞中，PD-L1可以作为抗凋亡因子起作用，表达到APC上的PD-L1可与T细胞的相关蛋白结合，降低T细胞活性和细胞因子的生成，同时可以上调PD-L1的表达，使T细胞释放干扰素，引起失活的T细胞表达PD-1，进一步引起肿瘤细胞获得逃避免疫清除的能力。MMP-9正常情况表达于肿瘤细胞，尤其是高转移潜能的肿瘤细胞，其可以促进肿瘤细胞周围基质和基底膜发生降解，引起肿瘤细胞离开原灶并形成迁移，同质性黏附和异质性黏附共同起作用，使肿瘤细胞出现转移〔9〕。

本文结果显示PD-1、PD-L1和MMP-9三者高表达是促进肿瘤细胞生成的重要因素。由于PD-1表达于间质，是细胞微环境的一部分，其在流式细胞半定量时表达较好。本文结果显示PD-1、PD-L1和MMP-9三者高表达可以促进肿瘤的生长及细胞增殖。PD-L1可以在肿瘤细胞中表达，而正常机体的细胞中常不表达。PD-1通路能降低肿瘤局部微环境T细胞免疫效应，介导肿瘤免疫逃逸，引起肿瘤的生长〔10〕。其机制有：①诱导并增加T细胞数量；②增强肿瘤特异性的杀伤活性；③使促炎相关因子高表达；④引起T细胞聚集现象；⑤下调潜在的抑制性细胞因子。有研究认为PD-1和PD-L1是负性共刺激分子，肿瘤细胞高表达 PD-L1，其与PD-1结合后，传导抑制性信号，减少 CD8+T淋巴细胞增殖，甚至诱导T淋巴细胞凋亡，导致机体抗肿瘤免疫反应下降，肿瘤细胞得以发生、发展〔11〕。而且PD-1/PD-L1信号通路可以抑制干扰素的产生，刺激T淋巴细胞分泌白细胞介素10，抑制T细胞的活性〔12〕。本文结果提示MMP-9高表达时可以促进肿瘤淋巴道播散。MMP-9是转移相关的蛋白，其具有多向调节作用，如对血管生成的调节作用、促进细胞增殖等〔13，14〕，本实验提示PD-1、PD-L1和MMP-9三者间无协同作用，因此PD-1/PD-L1和MMP-9的调节可能是通过各自的通路完成的。

1邱雪杉，李庆昌，谢成耀，等.非小细胞肺癌中MMP-9、TIMP-1表达与转移和预后的关系〔J〕.中华结核和呼吸杂志，2003；26(1)：55-7.

2Dincecco A，Andreozzi M，Ludovini V，etal.PD-1 and PD-L1 expression in molecularly selected non-small-cell lung cancer patients〔J〕.Brit J Cancer，2015；112(1)：95-7.

3罗 彬，秦 蓁，王旭东.肺癌MMP-9、TIMP-1表达与微血管密度的关系及意义〔J〕.临床与实验病理学杂志，2009；25(5)：510-2.

4Ohaegbulam KC，Assal A，Lazar-Molnar E，etal.Human cancer immunotherapy with antibodies to the PD-1 and PD-L1 pathway〔J〕.Trends Molec Med，2015；21(1)：24-33.

5Soares KC，Rucki AA，Wu AA，etal.PD-1/PD-L1 blockade together with vaccine therapy facilitates effector T-cell infiltration into pancreatic tumors〔J〕.J Immunother，2015；38(1)：1-2.

6Zhang Y，Kang S，Shen J，etal.Prognostic significance of programmed cell death 1 (PD-1) or PD-1 ligand 1(PD-L1) expression in epithelial-originated cancer：a meta-analysis〔J〕.Medicine，2015；94(6)：e515.

7李明彪，徐 嵩，范海洋，等.PD-1和PD-L1在肺类癌中的表达情况和其临床意义〔J〕.中国肺癌杂志，2016；19(12)：847-53.

8Dezutter-Dambuyant C，Durand I，Alberti L，etal.A novel regulation of PD-1 ligands on mesenchymal stromal cells through MMP-mediated proteolytic cleavage〔J〕.Oncoimmunology，2016；5(3)：e1091146.

9付 伟，吕 铮，刘爱东，等.非小细胞肺癌组织中MMP-9和E-cadherin的表达变化及意义〔J〕.山东医药，2009；49(10)：69-70.

10Lei Z，Cheng L，Fei L，etal.A blockade of PD-L1 produced antitumor and antimetastatic effects in an orthotopic mouse pancreatic cancer model via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway〔J〕.Oncotargets Ther，2017；10(10)：2115-26.

11冷雪娇，王建丰，徐云华，等.PD-L1对肺癌细胞迁移能力的影响〔J〕.现代肿瘤医学，2017；25(9)：1341-5.

12马 薇，罗殿中，陈 源，等.PD-L1和PD-1在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义〔J〕.实用医学杂志，2011；27(9)：1551-4.

13曹纪伟，刘德森，潘 泓，等.非小细胞肺癌MMP-9、TIMP-1的表达与转移预后的相关性研究〔J〕.中国癌症防治杂志，2010；2(3)：179-82.

14薛 洋，周清华，张尚福，等.MMP-2、MMP-9在肺癌中的表达及其与肺癌转移和预后关系的研究〔J〕.华西医学，2008；23(2)：225-7.