维生素C对内皮细胞和平滑肌细胞增殖的影响

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(浙江理工大学生命科学学院，杭州 310018)

0 引 言

每年有数百万患者植入心血管支架，但心血管支架的主要问题之一是人造材料与血液接触有形成血栓或血块的趋势，血栓阻碍血液流向心脏或其他重要器官，可能具有致命的后果，因此，心血管支架的内皮化对预防血栓的形成至关重要[1-2]。正常和健康的内皮细胞(Endothelial cells，ECs)通过释放前列环素和一氧化氮来防止血栓形成，前列环素和一氧化氮可以阻止血栓形成的关键步骤是抑制血小板粘附、聚集和活化，并且内皮细胞表面含有血栓调节蛋白，该蛋白在为这些细胞提供抗凝血过程中起着至关重要的作用[3-4]。尽管过去已经研发多种材料来改善血管支架的血液相容性，但是内皮化仍然被认为是长期避免血栓形成的最佳方法。

目前可用的药物洗脱支架(Drug-eluting stent，DES)通过释放抗增殖药物如雷帕霉素(Sirolimus，SIR)和紫杉醇(Paclitaxel，PAT)来治疗内膜增生[5]。内膜增生是在植入支架期间发生动脉损伤的伤口愈合反应，内膜增生发生的主要原因是平滑肌细胞(Smooth muscle cells，SMCs)的生长和迁移导致管腔内的细胞外基质沉积阻塞动脉[6-7]。支架释放的抗增殖药物能够抑制SMC的生长来控制内膜增生，但这些药物同时也会抑制EC生长[8]。药物洗脱支架的受损或延迟内皮化被认为是晚期支架血栓形成的主要原因，严重的并发症可能导致心脏病发作或死亡[9-10]。PAT血管支架表现出显著的延迟内皮化，这可能会导致晚期血栓的形成[11]。因此，有必要寻找一种既能抑制SMC生长又能促进EC生长的药物。维生素C(L-ascorbic acid，L-AA)是一种用于口服给药或者直接添加到细胞培养中的药物，相关研究发现L-AA在调节炎症反应中发挥作用，同时也对EC有一定的保护作用[12-14]。

本文研究的长期目标是从DES释放L-AA来改善支架的内皮化，防止晚期血栓形成以及抑制SMC生长，从而防止新生内膜增生。作为实现这一研究目标的第一步，本文进行四组体外细胞培养实验，以验证与其他常用于心血管支架的药物(SIR)相比，L-AA可以促进EC生长的同时抑制SMC的生长。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠主动脉平滑肌细胞、内皮祖细胞(中国科学院上海科学院)，胎牛血清和胰酶消化液(美国Gibco公司)，高糖DMEM培养基(美国Hyclone公司)，MTT、维生素C和雷帕霉素(美国sigma-aldrich公司)，DMSO和live/dead染液(美国Thermo Fisher公司)。所用试剂均为分析纯。

1.2 溶液配制

MTT(5 mg/mL)：称取500 mg MTT，溶于100 mL PBS中，磁力搅拌器搅拌至溶解，4 ℃避光保存。

L-AA母液：称取20 mg L-AA，溶于1 mL杜氏磷酸缓冲液(Dulbecco’s phosphate buffered saline, DPBS)中，4 ℃避光保存。

SIR母液：称取20 mg SIR，溶于1 mL无水乙醇中，4 ℃保存。

1.3 L-AA和SIR对两种细胞增殖作用的研究

将L-AA母液用高糖培养基(Dulbecco’s modified eagle medium, DMEM)稀释至300 μg/mL，SIR母液用DMEM培养基稀释至100 μg/mL。取对数生长期的EC和SMC细胞均以1.5×104个/mL的浓度、100 μL接种于96孔板中，37 ℃二氧化碳培养箱培养过夜，分别加入100 μL L-AA、SIR、DMEM、0.5% DPBS和0.5%乙醇溶液。1、3、5 d和7 d(每隔1 d换一次液)观察细胞生长形态，再加入10 μL MTT溶液，放置细胞培养箱培养4 h后，吸净孔板中的细胞培养基，每孔加入150 μL DMSO，放在摇床上10 min，转速为120 r/min。用酶标仪在490 nm处测量吸光值。计算细胞存活率，利用Sigmaplot软件进行统计学分析。

1.4 不同的L-AA浓度对两种细胞增殖作用的研究

将L-AA母液用DMEM培养基稀释至1、100、300、500 μg/mL和1000 μg/mL。取100 μL对数生长期、浓度为1.5×104个/mL的EC和SMC细胞接种于96孔板中，37 ℃二氧化碳培养箱培养过夜，分别加入1、100、300、500 μg/mL和1000 μg/mL的L-AA溶液和DMEM，DPBS溶液各100 μL。分别在1、3、5 d和7 d(每隔1 d换一次液)观察细胞生长形态，加入10 μL MTT溶液，再放置细胞培养箱培养4 h后，吸净孔板中的细胞培养基，每孔加入150 μL DMSO，放在摇床上10 min，转速为120 r/min。用酶标仪在490 nm处测量吸光值。计算细胞存活率，利用Sigmaplot软件进行统计学分析。

1.5 live/dead荧光染色观察细胞形态

1.5.1 L-AA和SIR对两种细胞增殖作用的影响

将L-AA母液用DMEM培养基稀释至300 μg/mL，SIR母液用DMEM培养基稀释至100 μg/mL。取对数生长期的EC和SMC细胞以1.5×104个/mL的浓度、500 μL接种于24孔板中，37 ℃二氧化碳培养箱培养过夜，分别加入L-AA，SIR，DMEM，0.5% DPBS，0.5%乙醇溶液。在1、3、5 d和7 d(每隔1 d换一次液)，加入live/dead荧光染料，室温避光染色30 min，在倒置荧光显微镜下观察，并拍照记录。

1.5.2 不同的L-AA浓度对两种细胞增殖作用的影响

将L-AA母液用DMEM培养基稀释至1、100、300、500 μg/mL和1000 μg/mL。取对数生长期的细胞EC和SMC均以1.5×104个/mL的浓度、500 μL接种于24孔板中，37 ℃二氧化碳培养箱培养过夜，分别加入1、100、300、500 μg/mL和1000 μg/mL的L-AA溶液、DMEM和DPBS溶液。在1、3、5 d和7 d(每隔1 d换一次液)，加入live/dead荧光染料，室温避光染色30 min，在倒置荧光显微镜下观察，并拍照记录。

在实验1.3和1.5.1中，将不同的药物加入EC和SMC细胞中，由于0.5%乙醇(溶于SIR)或是0.5% DPBS(溶于L-AA)都溶于培养基，因此以上实验设有3个对照组，对照组1为DMEM并且不加药和任何溶剂(乙醇溶液或是DPBS)，对照组2为0.5% DPBS溶于DMEM(不加L-AA)，对照组3为0.5%乙醇溶于DMEM(不加SIR)。

在实验1.4和1.5.2中，将不同剂量的L-AA加入细胞EC和SMC，由于L-AA溶于DPBS，因此以上实验设有2个对照组，对照组1为DMEM并且不加药和任何溶剂(乙醇溶液或是DPBS)，对照组2为10% DPBS溶于DMEM(不加L-AA)。

2 实验结果与分析

2.1 L-AA和SIR对内皮细胞增殖作用的影响

用MTT法检测EC细胞在加入不同药物处理后的活性，结果如图1所示。在第1 d，3个对照组和L-AA没有明显的差异，而SIR与对照组或是L-AA相比，只有较少的细胞数量。在第3 d，L-AA相比于第1 d细胞有一定增殖趋势，但与对照组相比略低；而SIR与第1 d相比，细胞数量没有明显的增殖，第5 d和第7 d可以看到相似的规律。以上结果表明，L-AA有促进EC增殖的能力，而SIR能够抑制EC的增殖。采用live/dead荧光染色观察细胞形态及数量，结果如图2所示，结果表明，与3个对照组和L-AA相比，随着天数的增加，SIR的细胞数量无明显的增长，而L-AA细胞数量有一个稳定的增长，但与对照组相比略低，这与图1所述的MTT检测结果一致。

图1 L-AA和SIR对EC细胞增殖作用的影响

图2 L-AA和SIR对EC细胞增殖作用的live/dead荧光染色

2.2 不同的L-AA浓度对内皮细胞的增殖影响

EC细胞中加入不同浓度L-AA的MTT检测结果如图3所示，在第1 d，500 μg/mL的L-AA和对照组与其他浓度组有明显的差异。第3 d时，除了500 μg/mL和1000 μg/mL，对照组和其他浓度组都有明显的增长，第5 d有相似的增长趋势。在第7 d，1、100、300 μg/mL的L-AA与其他浓度组及对照组相比，达到最高的细胞增殖量，1000 μg/mL的L-AA细胞增殖量最少。以上结果表明，1、100、300 μg/mL的L-AA有利于EC增殖，而500 μg/mL和1000 μg/mL的L-AA会抑制EC细胞增殖。live/dead荧光染色的结果如图4，与两个对照组相比，随着天数的增加，1、100 μg/mL和300 μg/mL的L-AA处理EC细胞保持较高的增殖水平，而500 μg/mL和1000 μg/mL的L-AA的细胞增殖量不高，这与所述的MTT结果一致。

图3 不同浓度的L-AA对EC细胞增殖作用的影响

图4 不同浓度的L-AA对EC细胞增殖作用的live/dead荧光染色

2.3 L-AA和SIR对平滑肌细胞增殖作用的影响

用MTT法检测SMC细胞在加入不同药物之后的活性的结果如图5所示。在第1 d，L-AA和SIR处理细胞数目明显低于对照组；第3 d，加入L-AA和SIR后SMC细胞有微量的增长，与对照组相比较仍旧很低，同时L-AA和SIR之间没有明显的差异。第5 d和第7 d有相似的趋势。因此L-AA可以显著的抑制SMC的增殖，尽管抑制效果稍低于SIR。live/dead荧光染色的结果如图6，与3个对照组相比，随着天数的增加，SIR和L-AA组的细胞数量极少，并且没有明显的增长，这与所述MTT结果一致。

图5 L-AA和SIR对SMC细胞增殖作用的影响

图6 L-AA和SIR对SMC细胞增殖作用 的live/dead荧光染色

2.4 不同浓度L-AA对平滑肌细胞增殖作用的影响

SMC细胞中加入不同浓度L-AA的MTT结果如图7所示。第1 d，与对照组相比较而言，300 μg/mL和500 μg/mL的L-AA显示较低的增殖量，1 μg/mL和100 μg/mL与对照组相比无明显差异。第3 d，300 μg/mL和500 μg/mL的L-AA和对照组相比依旧显示较低水平的增殖量，而1000 μg/mL的L-AA与第1 d相比增殖量显著下降。第5 d和第7 d有显示相似的规律。同时，笔者采用live/dead荧光染色观察细胞形态及数量，结果如图8所示，结果表明，与2个对照组相比，1、100 μg/mL和1000 μg/mL的L-AA随着天数的增加细胞数量也在不断增加，而300 μg/mL和500 μg/mL的L-AA细胞增殖量较低。这与上述的MTT检测结果一致，300 μg/mL和500 μg/mL的L-AA与其他浓度组及对照组相比能够显著抑制SMC增殖。

图7 不同浓度的L-AA对SMC细胞增殖作用的影响

图8 不同浓度的L-AA对SMC细胞增殖作用的live/dead荧光染色

3 结 论

本文通过比较在相同条件下L-AA和SIR对EC和SMC的影响，发现SIR能够抑制EC增殖，而L-AA可以促进EC增殖的同时抑制SMC增殖。不同浓度L-AA对EC和SMC的研究表明1、100、300 μg/mL的L-AA有利于EC增殖，而500 μg/mL和1000 μg/mL的L-AA会抑制EC增殖；300 μg/mL和500 μg/mL的L-AA可以显著抑制SMC增殖。因此本文表明L-AA的作用效果优于SIR，可以成为潜在的应用于药物洗脱支架的药物。

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