LBH589/来那度胺调控多发性骨髓瘤细胞中IRF4并促进凋亡反应的研究

唐思诗，马 丹，成冰清，余琨琳，王季石△，彭 焱

(1.贵州医科大学，贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院血液科，贵阳 550004；3.南华大学附属怀化医院血液科 418000;4.湖南省人民医院肿瘤科，长沙 410000)

多发性骨髓瘤(MM)是一种侵袭性强并且不可治愈的血液系统恶性肿瘤[1]。目前为止，来那度胺、硼替佐米等仍然是MM的首选药物，然而，部分MM患者在治疗后仍然复发,对骨髓瘤细胞致病机制的深入研究显示，干扰素调节因子4(IRF4)是骨髓瘤生长中不可缺少的转录因子，在骨髓瘤细胞中表达失调，而且会在相应的肿瘤细胞染色体上发生变异、扩增和突变[2]。表明IRF4可以作为寻找治疗MM的新的治疗靶点,而降低MM的耐药复发性已经成为MM的重要问题。

LBH589是一种FDA批准为治疗MM的化疗药物，已经用于临床治疗MM患者，它是一种广谱的去乙酰化酶抑制剂[3],作用机制很多，目前尚不完全明确。而来那度胺是一种免疫调节剂，已经用于MM的治疗[4],但MM患者仍然会产生耐药或者复发。目前组蛋白乙酰化酶抑制剂(HDACi)与其他化疗药物联合治疗是诱导肿瘤细胞凋亡的主要方法，并且可以有效减少肿瘤细胞的耐药以及复发[5]。本研究主要分析LBH589单药或者联合来那度胺在MM中的作用机制以及相关靶点，为临床治疗MM患者提供新的治疗方法。

1 材料与方法

1.1材料 人MM细胞株RPMI8226以及人MM耐来那度胺细胞株RPMI8226-R由贵州医科大学附属医院造血干细胞移植中心实验室冻存。LBH589(帕比斯他)购自美国Selleck公司,TRIzol、逆转录试剂盒均为美国Invitrogen公司产品，CCK8、二甲基亚砜(DMSO)为赛兰博科技有限公司产品，RPMI-1640培养基、胎牛血清购自杭州四季青公司，AnnexinV-FITC/PI试剂盒(凯基生物)、HO-1一抗及二抗购自碧云天生物技术研究所，Bax一抗购自上海晶天生物技术有限公司,PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1细胞培养 RPMI8226和RPMI8226-R使用含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素及100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养基37 ℃、5% CO2、100%饱和湿度CO2培养箱培养，细胞接种密度(4～5)×105个/mL，使用处于对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2细胞增殖抑制检测 台盼蓝检测细胞活力，LBH589单独或者联合来那度胺处理RPMI8226细胞24 h，根据制造商的指导，将5×103个细胞在培养基中或不用处理的96孔板中孵育，然后向每个孔中加入20 μL的CCK8溶液。在37 ℃下孵育40 min后，使用分光光度计测量450 nm处的吸光度，作出细胞增殖抑制率的曲线。

1.2.3细胞凋亡率检测 取对数生长期的RPMI8226细胞，调整细胞密度2×105个/mL，接种于6孔板，每孔1 mL，同时设置空白对照组、LBH589组，用预冷的PBS洗涤细胞2次，加入195 μL AnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5 μL膜联蛋白V-FITC，轻轻混匀。室温避光孵育10 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入190 μL AnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置，随即进行流式细胞仪检测，每组平行实验3次。

1.2.4Western blot检测 收集各组细胞，提取细胞总蛋白。每份样本取 40 μg总蛋白，经10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转移至醋酸纤维素膜上，经封闭液封闭过夜后加鼠抗人β-actin一抗(1∶500)，兔抗人HO-1一抗(1∶1 000)，兔抗人IRF4一抗(1∶500)，兔抗人 c-Myc一抗(1∶500)，兔抗人Bcl-2一抗(1∶1 000),兔抗人Bcl-xl一抗(1∶1 000),兔抗人Bax一抗(1∶1 000),兔抗人c-PARP一抗(1∶1 000),兔抗人Bad一抗(1∶1 000)室温摇膜90 min后TBST洗膜，分别加入兔IgG二抗(1∶1 000)室温孵育45 min，TBST洗膜后用ECL试剂染色后曝光，每个实验至少重复3次。

1.2.5Real-time PCR检测 使用Trizol试剂(Invitrogen，美国)从细胞株中提取总RNA。使用SYBR Green PCR Master Mix(北京天根生物)和PRISM 7500实时PCR系统(ABI，美国)进行qPCR。分析相对于β-actin基因转录物水平的基因表达水平。cDNA样品与引物和SYBR Master Mix混合，总体积为20 μL。方案中使用的热循环条件在94 ℃下1 min；随后在94 ℃下持续10 s，在60 ℃下持续15 s进行40个循环。

2 结 果

2.1LBH589与来那度胺单独或者联合作用于RPMI8226细胞后的增殖抑制率 LBH589与来那度胺分别作用于RPMI8226的增殖抑制率呈剂量依赖关系,LBH589在浓度为0.08 μmol/L时，来那度胺浓度为20 μmol/L时，作用浓度分别达到峰值。LBH589联合来那度胺比单用LBH589或者来那度胺效果明显，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

*:P<0.05,**:P<0.01，与空白对照组比较

图1 LBH589与来那度胺对RPMI8826增殖抑制率的影响

2.2LBH589和来那度胺单独或者协同诱导细胞凋亡 LBH589单独或者协同诱导RPMI8226细胞凋亡呈剂量依赖关系，RPMI8226细胞凋亡率随着LBH589浓度的增加而增加。LBH589 0.01、0.02 μmol/L时诱导RPMI8226细胞凋亡率分别为(11.6±7.42)%、(27.66±7.1)%，单独使用来那度胺2.5 μmol/L时凋亡率为(12.8±6.94)%，联合用药后，各株细胞凋亡率大幅度增长，在LBH589 0.01 μmol/L以及0.02 μmol/L，来那度胺为2.5 μmol/L

图2 LBH589与来那度胺对RPMI8826细胞凋亡的影响

时凋亡率分别为(36.4±11.1)%、(68.37±14.4)%，说明LBH589和来那度胺联合应用时，显著协同诱导凋亡作用，组间差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

图3 LBH589与来那度胺对RPMI8826细胞凋亡相关蛋白的影响

2.3LBH589单独以及联合来那度胺作用于RPMI8226细胞后对凋亡相关Bcl-2、Bcl-xl、bad、Bax、c-PARP蛋白表达水平的影响 凋亡相关蛋白水平在LBH589与来那度胺合用时表达最低，与空白对照组(未处理组)比较，在用LBH589或者来那度胺后，细胞抗凋亡蛋白均有所下降，凋亡蛋白有所增加,见图3。

A：Western blot检测不同细胞株中IRF4蛋白的表达，以及LBH589处理后IRF4、c-MYC等蛋白的表达，以β-actin为内参；B：Realtime PCR检测不同浓度LBH589处理后IRF、c-MYC在mRNA水平上的表达。C：不同浓度LBH589单独或者联合来那度胺处理RPMI8226细胞24 h后IRF4、c-MYC等蛋白的表达,以β-actin为内参，*：P<0.05，**：P<0.01，与空白对照组比较

图4 LBH589作用于RPMI8226细胞后IRF4、c-MYC表达下降

A:使用Realtime PCR检测RPMI8226细胞与RPMI8226-R细胞HO-1与IRF4等mRNA的表达,以β-actin为内参，CCK8检测细胞的增殖抑制率；B：Western blot检测调控HO-1后IRF4、c-MYC蛋白水平的表达，以β-actin为内参；*：P<0.05，**：P<0.01，与对照组比较；C：CCK8检测LBH589单独或者联合来那度胺24 h后细胞的增殖抑制率

图5 HO-1及IRF4对LBH589作用于RPMI8226-R细胞的影响

2.4LBH589诱导RPMI8226细胞中IRF4、c-MYC转录因子的下降 Western blot检测不同来源的血液恶性肿瘤中IRF4的蛋白水平，发现IRF4在骨髓瘤细胞株中表达最高。检测相关转录基因IRF4、c-MYC等转录因子蛋白表达随LBH589浓度增高而明显减低,以β-actin为内参,与空白对照组比较，IRF4各蛋白表达随LBH589浓度增加而降低明显，见图4A。其作用浓度同Realtime PCR浓度一致，见图4B。联合使用药物后，IRF4与c-MYC表达更加低,差异有统计学意义(P<0.05),见图4C。

2.5检测RPMI8226、RPMI8226-R中HO-1、IRF4的表达，此时LBH589产生的增殖抑制率作用比IRF4表达低的明显减少(图5A)。使用Hemin 提高HO-1的表达，ZNPP降低HO-1的表达，使用Realtime PCR检测IRF4的表达，发现IRF4表达与HO-1下降的程度一致(图5B),使用LBH589单独或者联合来那度胺处理RPMI8226以及RPMI8226-R后检测发现RPMI8226-R的增殖抑制率率低于RPMI8226，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5C。

3 讨 论

本研究分别观察了广谱组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589和来那度胺单独或者协同作用于骨髓瘤细胞系RPMI8226导致的增殖抑制以及凋亡的作用，结果显示LBH589与来那度胺协同抑制肿瘤细胞的增殖以及诱导凋亡的作用，但相应机制并不清楚。LBH589作为一种广谱的去乙酰化酶抑制剂，是FDA批准为治疗MM的化疗药物[3]。而来那度胺是一种免疫调节剂，已经用于MM的治疗[4],但MM患者仍然会产生耐药或者复发。目前HDACi与其他化疗药物联合治疗是诱导肿瘤细胞凋亡的主要治疗方法，并且可以有效减少肿瘤细胞的耐药以及复发[5]。为此本课题组选择使用LBH589与来那度胺联合治疗MM，并且探讨其相应的机制，结果发现，Bcl-2随着药物的作用表达逐渐下降，且Bax出现出上升趋势，在不同的效应细胞中，Bcl-2、Bax等蛋白因子在HDACi和免疫调节剂诱导肿瘤细胞凋亡中的分子机制还有待进一步的研究。

本实验中已经探查出IRF4在骨髓瘤细胞中高表达，与之前的研究一致[6]，本研究也证实了IRF4在骨髓瘤中表达水平也高于其他的血液恶性肿瘤细胞，为进一步评价LBH589与来那度胺联合治疗MM的相应的机制，本研究选择了人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞，证实随着LBH589与来那度胺单独或者联合作用时IRF4表达下降，c-MYC的表达不太明显,提示IRF4涉及LBH589和来那度胺诱导骨髓瘤凋亡的分子机制。

IRF4又称为多发性骨髓瘤癌基因1，仅表达于淋巴系统，并且参与了淋巴系统的发育[7],IRF4又是B细胞发育和功能的关键转录调节因子[8]。IRF4基因在淋巴系、造血系统等肿瘤中常常发生变异，其表达水平可作为临床相关肿瘤治疗的预后标志[5,9]，此外，IRF4调控区有着c-MYC结合位点，c-MYC属于MYC家族，是一类表达较弱，但相对稳定，影响范围非常广泛的转录因子，c-MYC调控区也存在着IRF4的结合位点[10]，为了更进一步地证实IRF4参与了LBH589以及来那度胺介导的凋亡作用，本课题组加用了RPMI226-R细胞株，因为RPMI8226细胞株中IRF4表达较RPMI8226-R高，由此来进一步证实IRF4参与了LBH589以及来那度胺介导的细胞增殖作用，接下来，本课题组通过CCK8实验证实了高表达的IRF4的RPMI8226-R的确影响了LBH589单独以及联合来那度胺导致的细胞增殖作用。更近一步得出LBH589单独或者联合来那度胺作用引起的细胞凋亡与IRF4降低有关，IRF4是潜在骨髓瘤药物的治疗靶点。已有研究证实激活蛋白-1(AP-1)寡聚复合体增强HO-1启动子活性[11]。BODDICKER等[12]也已经证明AP-1是IRF4的启动子，本课题组已经证实HO-1在MM以及其他血液恶性肿瘤中高表达,并且与凋亡、耐药相关[13-14]。因此笔者考虑IRF4的高表达引起的凋亡减少是否也与HO-1存在相关性，HO-1与IRF4的相关性值得进一步研究。本研究表明Hemin提高HO-1表达以及ZNPP降低HO-1的表达均可以影响MM中IRF4、c-MYC的表达水平，证实二者存在相关性。HO-1、IRF4、c-MYC三者相互之间复杂的调控环路以及在肿瘤细胞中表达的失调，考虑HO-1/IRF4/c-MYC轴可用于治疗MM的靶点，有潜力应用于今后MM的治疗，其具体分子机制有待于进一步深入研究。

综上所述，LBH589可抑制RPMI8226细胞的增殖且诱导凋亡，联合来那度胺后这种作用更明显。使用LBH589与来那度胺治疗后明显降低了IRF4以及轻微下调其下游c-MYC,使得抗凋亡蛋白Bcl-2下降以及促凋亡蛋白Bax表达增加而促进MM细胞的凋亡，HO-1是MM的一个治疗靶点，当增强或者沉默HO-1时，IRF4与c-MYC明显与HO-1的表达一致,这些数据均可表明IRF4有潜力成为去乙酰化酶抑制剂的治疗靶点，而HO-1/IRF4/c-MYC轴也有潜力用于治疗MM。

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