VEGF基因调控TGF-β1信号转导通路在鼻咽癌转移中的机制及临床意义

黄中 邵汛帆 郑乃莹

广州医科大学附属肿瘤医院放疗科（广州510095）

细胞信号转导的异常是肿瘤发生的分子基础。血管内皮生长因子（VEGF）基因调控转化生长因子-β1（TGF-β1）信号转导通路在与肿瘤的发生、发展、转移等密切相关，其中TGF-β1是一种具有双向调节功能细胞因子，在细胞生长、分化等方面发挥重要的作用［1］。有实验结果显示［2］VEGF是TGF-β1信号通路的直接靶点，TGF-β1能增强脂多糖诱导的VEGF的生成，而TGF-β1单独却不能。该通路既往在乳腺癌报道较多，并指出TGF-β可促进乳腺癌血行转移至肺［3］，但在鼻咽癌（NPC）方面的报道较少。本实验用免疫组化法检测局部中晚期鼻咽癌组织中VEGF、TGF-β1的表达情况，结合患者临床特点及预后，分析其相关性并对其预后进行多因素综合分析。有助于临床上对鼻咽癌转移的预测及预后评价。

1 资料与方法

1.1 临床资料及标本来源收集2008年6月至2012年8月在本院治疗的局部中晚期鼻咽癌患者治疗前的鼻咽局部组织蜡块，共96例。其中男73例，女23例；年龄18～60岁之间，中位年龄45岁；分期依据我国鼻咽癌2008分期标准，其中Ⅲ期60例和Ⅳa期36例；病理诊断均为鼻咽未分化型非角化性癌；治疗方法为诱导化疗加同期放化疗，且放化疗方案相同。随访中38例出现远处转移，其中单纯骨转移16例，单纯肺转移8例，单纯肝转移2例，多器官转移12例。

1.2 免疫组化检测方法组织标本以10%福尔马林液固定，常规石腊包埋，制成5 μm厚切片，烤片60℃2 h。采用Dako Link Omnis染色系统，SP免疫组化染色法。用已知阳性组织标本作阳性对照；以PBS代替一抗作阴性对照。具体操作如下：（1）采用三合一修复液Env FLEX TRS，High HP 97℃孵育20 min，清洗；（2）分别滴加VEGF、TGF-β1一抗工作液，37 ℃孵育10 min，清洗；（3）3%H2O2，孵育10 min，清洗；（4）滴加非生物素标记的二抗，Env FLEX/HRP 37℃孵育12 min，清洗；（5）DAB底物色原显色，清洗；（6）复染苏木素，清洗；（7）脱水，封片。

1.3 结果判读染色结果采用以下方案，分别由两位病理科副主任医师独立地阅片，再进行综合计分及判断：VEGF阳性细胞主要为胞浆着色，细胞不着色为阴性（-）；阳性细胞数＜25%为弱阳性（+）；阳性细胞数26%～50%为阳性（++）；阳性细胞数＞50%为强阳性（+++）。TGF-β1阳性细胞主要为胞浆着色（黄色或棕黄色），将显色细胞数百分比规定为，阳性细胞数＜1/3计为1分，1/3～2/3计为2分，≥2/3计为3分；将细胞质染色的深浅度规定为无着色细胞为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；百分比×深浅度为最后得分；0分判定为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～4分为中等度阳性（++），6～9分为强阳性（+++）。

1.4 疗效观察和随访放化疗以后5年内每3个月进行1次复查。随访终点为转移或者死亡。计算5年无转移生存率（metastasis-free survival，MFS）及5年生存率（overall survival，OS）。

1.5 统计学方法应用SPSS 19.0软件对数据进行统计学处理，VEGF及TGF-β1的表达与性别、年龄、局部侵犯、淋巴转移等临床指标的关系用χ2检验；以Kaplan-Meier法分析生存率，并通过Log rank检验；用Cox模型进行单因素及多因素的预后分析。

2 结果

2.1 VEGF与TGF-β1信号通路各分子在局部中晚期鼻咽癌组织中的表达及其相关性结果显示VEGF阳性的表达率66.7%，TGF-β1阳性的表达率53.1%。VEGF和TGF-β1在中晚期鼻咽癌的表达成正相关。VEGF和TGF-β1均与淋巴转移有显著相关性，而与年龄、性别、局部侵犯等无明显相关。见图1、表1～3。

图1 免疫组织化学染色检测VEGF和TGF-β1在鼻咽癌组织中的表达Fig.1 Representative immunohistochemistry images of VEGF staining（A）and TGF-β1 staining（B）in nasopharyngeal carcinoma tissue

表1 96名病人中VEGF和TGF-β1的表达情况Tab.1 Expression of VEGF and TGF-β1 in 96 patients with NPC例

表2 VEGF与TGF-β1在鼻咽癌组织中表达的相关性Tab.2 Correlations between VEGF and TGF-β1 expression in NPC 例

2.2 VEGF与TGF-β1表达与患者预后的关系鼻咽癌组织中VEGF与TGF-β1表达与患者5年MFS及OS的关系如表4所示。VEGF阴性患者与阳性患者MFS、OS的差异有显著性（P＜0.05）；TGF-β1阴性患者与阳性患者MFS、OS的差异有显著性（P＜0.01）。见图2、3。

2.3 Cox比例风险模型进行生存的单因素和多因素分析用Cox单因素相关分析VEGF、TGF-β1对MFS的影响。结果显示，VEGF阳性为不良预后因素（P＜0.05）。而TGF-β1阳性不是独立预后因素（P＞0.05）。用Cox多因素相关分析年龄、性别、淋巴转移、局部侵犯、VEGF和TGF-β1对MFS的影响。结果显示：VEGF阳性为不良预后因素（P＜0.01）。

表3 VEGF与TGF-β1的表达与鼻咽癌主要临床特点之间的关系Tab.3 Relationship between expression of VEGF and TGF-β1 and various clinicopathological features of NPC 例（%）

表4 VEGF与TGF-β1阴性与阳性的鼻咽癌患者的5年生存情况Tab.4 5-year survival rate of NPC patients with negative and positive expression of VEGF and TGF-β1 %

图2 Kaplan-Meier法分析VEGF与TGF-β1表达情况与鼻咽癌患者的5年总生存的关系Fig.2 5-year OS of NPC patients with negative and positive expression of VEGF and TGF-β1

3 讨论

我省是鼻咽癌发病率最高的地区，据不同文献报道Ⅲ、Ⅳ期的鼻咽癌患者约占70%，目前的三维适形调强放疗技术让鼻咽癌原发灶的控制率有了明显的提高，但是晚期鼻咽癌的5年OS仍仅约20%～30%，主要致死原因是远处转移的发生［4-.5］。

图3 Kaplan-Meier法分析VEGF与TGF-β1表达情况与鼻咽癌患者的5年无远处转移生存的关系Fig.3 5-year MFS of NPC patients with negative and positive expression of VEGF and TGF-β1

细胞信号转导的异常在肿瘤发生、进展、转移的分子机制和靶向治疗是目前研究的热点。VEGF基因调控TGF-β1信号转导通路与乳腺癌、肺癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤等多种肿瘤的发生发展转移密切相关［6］。血管的形成在恶性肿瘤的发生、发展及转归过程中起着重要作用，而VEGF的主要作用是形成新的血管［7］，VEGF诱导的MMPs不仅参与新血管的形成，还同时参与肿瘤侵蚀和转移的调控［8-9］。作为TGF-β1信号通路的直接靶点［1-2］，VEGF特别是VEGF-a可以结合2个酪氨酸激酶受体，促进内皮细胞分化、增殖、迁移和诱导MMP［10］。TGF-β1在细胞生长、分化及凋亡等方面的功能具有双向性，一方面它是潜在生理抑制因子，能够能抑制内皮细胞及肿瘤细胞的增殖［11］；另一方面它也通过促进内皮细胞的迁移和增殖来刺激血管的生成［12］，调节MMP的活性，从而促进肿瘤转移的发生［6］。同时，TGF-β1还可增强癌细胞的浸润能力，促进肿瘤的进展［13］。

本实验用免疫组化法检测局部中晚期鼻咽癌组织中VEGF、TGF-β1的表达情况，结合患者临床特点及预后，分析其意义。结果显示，VEGF与TGF-β1在局部中晚期鼻咽癌组织中高表达，并且表达成正相关。VEGF和TGF-β1均与淋巴转移有显著相关性，说明它们能较好地反映鼻咽癌细胞的转移能力，与血管形成促进肿瘤转移的理论相符。当然，VEGF基因调控TGF-β1信号转导通路还可能存在更为复杂的调控机制或者与其它信号转导通路之间的相互作用机制，需要进一步的动物实验，继续探讨该信号转导通路在鼻咽癌发生、发展、转移中的作用。

用Cox单因素相关分析VEGF、TGF-β1对MFS的影响。结果显示，VEGF高表达的患者与TGF-β1高表达的患者的OS均显著缩短，这与既往文献［14-15］报道基本一致。VEGF阳性为不良预后因素（P＜0.05），但TGF-β1阳性却不是独立预后因素（P＞0.05），可能与其在细胞生长、分化及凋亡等方面的功能具有双向性有关。用Cox多因素相关分析年龄、性别、淋巴转移、局部侵犯、VEGF和TGF-β1对MFS的影响。结果显示：VEGF阳性为不良预后因素（P＜0.01）。而淋巴转移及局部侵犯并不是不良预后因素，可能与入组的病例都为局部中晚期，以及入组病例数较少有关。

以上研究表明，VEGF和TGF-β1阳性与鼻咽癌细胞的转移能力相关。在临床上，对VEGF和TGF-β1阳性甚至高表达的患者应当制定更为积极的个体化治疗。如果能抑制它们的表达，则有可能在一定程度上抑制转移的发生。目前比较成熟的个体化治疗主要是抗血管生成疗法，全身热疗作为防止肿瘤远处转移的发生也已经在乳腺癌方面开始基础研究［16］。综上所述，通过对鼻咽癌组织当中VEGF和TGF-β1蛋白的表达情况的检测，可能有助于对鼻咽癌转移的预测及预后评价。对于高表达者应加强个体化综合治疗以提高生存率，延长生存期。

［1］YU J，LEI R，ZHUANG X，et al.MicroRNA-182 targets SMAD7 to potentiate TGFbeta-induced epithelial-mesenchymal transition and metastasis of cancer cells t［J］.NaCommun，2016，7：13884.

［2］KOIDE N，ODKHUU E，NAIKI Y，et al.Augmentation of LPS-induced vascular endothelial cell growth factor production in macrophages by transforming growth factor-beta1［J］.Innate Immun，2014，20（8）：816-825.

［3］METELLI A，WU B X，FUGLE C W，et al.Surface expression of TGFbeta docking receptor GARP promotes oncogenesis and immune tolerance in breast cancer［J］.Cancer Res，2016，76（24）：7106-7117.

［4］黄中，邵汛帆，郑乃莹，等.局部晚期鼻咽癌TPF方案诱导化疗联合IMRT同期化疗的临床观察［J］.中华生物医学工程杂志，2016，20（1）：50-53.

［5］黄中，邵汛帆，郑乃莹.鼻咽癌IMRT同期化疗的疼痛管理［J］.中国医药科学，2014，（20）：27-30.

［6］SEOANE J，GOMIS R R.TGF-beta family signaling in tumor suppression and cancer progression［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2017，9（12）.pii：a022277.doi：10.1101/cshperspect.a022277.

［7］ZHANG R，ZHAO Y，ZHANG S，LV J.The expressions of EphrinB2 and VEGF in nasopharyngeal carcinoma and their clinical significance［J］.Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi，2013，27（4）：178-180.

［8］LI W W，LONG G X，LIU D B，et al.Cyclooxygenase-2 inhibitor celecoxib suppresses invasion and migration of nasopharyngeal carcinoma cell lines through a decrease in matrix metalloproteinase-2 and-9 activity［J］.Pharmazie，2014，69（2）：132-137.

［9］LI X Y，LIN Y C，HUANG W L，et al.Zoledronic acid inhibits proliferation and impairs migration and invasion through downregulating VEGF and MMPs expression in human nasopharyngeal carcinoma cells［J］.Med Oncol，2012，29（2）：714-720.

［10］CHEN Z，XU X H.Combining antiangiogenic therapy and radiation in nasopharyngeal carcinoma［J］.Saudi Med J，2015，36（6）：659-664.

［11］DE CAESTECKER M P，PIEK E，ROBERTS A B.Role of transforming growth factor-beta signaling in cancer［J］.J Natl Cancer Inst，2000，92（17）：1388-1402.

［12］NEUZILLET C，DE GRAMONT A，TIJERAS-RABALLAND A，et al.Perspectives of TGF-beta inhibition in pancreatic and hepatocellular carcinomas［J］.Oncotarget，2014，5（1）：78-94.

［13］JOBLING A I，NGUYEN M，GENTLE A，MCBRIEN N A.Isoform-specific changes in scleral transforming growth factor-beta expression and the regulation of collagen synthesis during myopia progression［J］.J Biol Chem，2004，279（18）：18121-18126.

［14］ZHANG J X，CAI M B，WANG X P，et al.Elevated DLL4 expression is correlated with VEGF and predicts poor prognosis of nasopharyngeal carcinoma［J］.Med Oncol，2013，30（1）：390.

［15］孙蕊，陈明远，孙健，等.TGF-β1及其信号通路分子在鼻咽癌中的表达及其临床意义［J］.癌症，2007，26（9）：1005-1009.

［16］谢小雪，高福平，雷锋林，等.比较不同温度对乳腺癌侵袭转移能力的影响［J］.国际肿瘤学杂志，2010，37（2）：153-156.