酪酸梭菌对胆汁淤积大鼠的肠黏膜通透性和紧密连接蛋白的影响

马姝丽 李小芹 王菊平

郑州儿童医院，郑州大学附属儿童医院 1药学部，2消化内科（郑州450018）

肝内胆汁淤积症是由肝细胞和（或）毛细胆管胆汁排泌障碍引起的以胆汁流出部分或完全阻滞为特征的综合征，其症状主要为黄疸、肝功能异常、皮肤瘙痒等［1］，其发病率在出生婴儿约为1/2 500［2］。胆汁淤积时排进肠道内的胆汁减少，导致肠上皮细胞间紧密连接的断裂及表达的改变，肠黏膜屏障受损，导致肠道功能紊乱、肠源性感染。肠黏膜屏障受损时，大量细菌和内毒素从肠道经门静脉进入肝脏，激活肝内固有的巨噬细胞，分泌一系列细胞因子产生炎症级联反应，引起或加重肝损伤。肝与肠道间的相互作用，为胆汁淤积相关疾病的防治提供了新的切入点。酪酸梭菌是一种益生菌，能够促进肠道内菌群生态平衡，改善肠黏膜屏障，用于肠道菌群紊乱引起的急慢性腹泻和消化不良。临床研究表明酪酸梭菌能降低体内胆红素的水平［3］，可用于治疗新生儿高胆红素血症及胆汁淤积，但其具体作用机制仍不明确。本研究通过胆汁淤积大鼠模型，检测分析酪酸梭菌对大鼠血清生化指标的影响，观察肝组织病理学和小肠组织紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达变化，评价酪酸梭菌对胆汁淤积大鼠的肠黏膜通透性和紧密连接蛋白的的作用，探讨酪酸梭菌治疗胆汁淤积的内在机制，为临床治疗相关疾病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料酪酸梭菌（青岛东海药业有限公司）；α-荼基异硫氰酸盐（ANIT）溶液（美国Sigma公司）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清总胆红素（T-BIL）、二胺氧化酶（DAO）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；紧密连接蛋白（Occludin）、闭锁小带蛋白-1（ZO-1）多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.2 模型制备与给药40只雄性SD大鼠，鼠龄8周（河南省实验动物中心提供），随机分为正常（Con）组、模型（Mod）组、酪酸梭菌低（CBL，4.0×106CFU/kg）、高剂量（CBH，8.0× 106CFU/kg）组，每组大鼠10只。除正常组外，其余各组大鼠均按50 mg/kg灌胃ANIT橄榄油溶液制备大鼠肝内胆汁淤积模型［4］，并于造模次日开始灌胃相应药物，正常组和模型组灌胃蒸馏水，每天1次，连续5 d。

1.3 血清指标测定末次给药后禁食12 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，离心分离血清，按照试剂盒说明检测血清中ALT、AST、DAO的活性和T-BIL含量。

1.4 组织病理检测采血后取大鼠肝脏固定部位经甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，常规HE染色，于显微镜下观察肝组织病理学形态。

1.5 Werstern blotting检测采血后分离小肠组织，取100 mg小肠组织提取蛋白，BCA法测定蛋白含量，取适量蛋白样品变性，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白转移至PVDF膜上，奶粉封闭，漂洗后加Occludin一抗（1∶800）或ZO-1一抗（1∶500）4℃过夜，漂洗后以辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，漂洗后ECL曝光成像，用Image-Pro Plus 6.0软件分析，以目的蛋白的积分光密度/内参β-actin的积分光密度的比值作为蛋白的表达量

1.6 统计学方法采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清指标结果与Con组比较，Mod组大鼠血清中各项指标水平明显升高（P＜0.05）。与Mod组比较，CBL组、CBH组大鼠血清ALT、AST、DAO活性明显降低，T-BIL含量明显减少（P＜0.05），且酪酸梭菌各剂量组大鼠血清中生化指标水平随着酪酸梭菌剂量的增加而减少。见表1。

表1 大鼠血清中ALT、AST、T-BIL和DAO的含量Tab.1 The contents of ALT,AST,T-BIL and DAO in serum（n=10） ±s

表1 大鼠血清中ALT、AST、T-BIL和DAO的含量Tab.1 The contents of ALT,AST,T-BIL and DAO in serum（n=10） ±s

注：与Con组相比，*P＜0.05；与Mod组相比，▲P＜0.05

2.2 肝组织病理结果HE染色后光镜下观察，Con组肝脏肝小叶结构清晰，肝索由中央静脉向四周呈放射状排列，肝细胞无变性坏死和淋巴细胞浸润；Mod组大鼠肝组织的汇管区可见大量炎性细胞浸润，胆管上皮细胞增生，管腔狭窄，肝小叶结构不清；CBL组、CBH组大鼠肝组织炎性细胞明显减少，胆管上皮细胞增生减轻，管腔相对狭窄，病理较Mod组有所改善。见图1。

2.3 Werstern blotting结果与Con组比较，Mod组大鼠小肠组织中Occludin、ZO-1蛋白表达减少（P＜0.05）。与Mod组比较，CBL组、CBH组大鼠小肠组织中Occludin、ZO-1表达显著增加（P＜0.05）。见图2、表2。

3 讨论

自从马歇尔提出了“肝肠轴”的概念，肝脏疾病与肠道的作用就逐渐受到关注。机体肠道与肝脏间存在交互作用，如果肠道黏膜屏障功能受损，致使肠道黏膜的通透性发生改变，肠道内细菌和内毒素移位进入门静脉系统，机体产生一系列的炎症反应和免疫应答，可进一步造成肠道黏膜及远隔器官损伤。胆汁淤积时肠道内胆汁减少，导致肠上皮细胞间紧密连接的断裂及表达的改变，肠黏膜屏障受损，通透性增加。由于肝肠轴的存在，肝脏与肠道之间存在的相互作用为胆汁淤积相关疾病的防治提供了新的切入点，保护肠黏膜屏障可能是治疗肝脏相关疾病的开创性治疗方法［5］，本研究试图从益生菌调节肠黏膜紧密连接，保护肠黏膜屏障进而改善肝脏病理变化，探讨益生菌防治胆汁淤积及相关疾病的作用机制。

图1 各组大鼠的肝组织病理（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of liver tissues in rats(HE staining,×200)

图2 Westernblotting大鼠小肠组织中Occludin和ZO-1的表达Fig.2 The expression of Occludin and ZO-1 proteins in small intestines

表2 大鼠小肠组织中Occludin和ZO-1的蛋白表达Tab.2 The expression of Occludin and ZO-1 in small intestines（n=10） x ± s

α-荼基异硫氰酸盐诱发大鼠胆汁淤积在病理上主要表现为肝实质细胞和胆管上皮细胞损伤，造成胆管阻塞引起胆汁淤积，与人类肝内胆汁淤积性肝病极为相似，因此常被用来复制胆汁淤积型肝炎动物模型［6］。本研究用α-荼基异硫氰酸盐灌胃大鼠复制模型，大鼠血清中的ALT、AST和TBIL较正常组大鼠明显升高，且模型大鼠肝组织病理切片可见胆管上皮细胞的增生、坏死，大量炎性细胞浸润，表明本实验建立大鼠胆汁淤积模型成功。

益生菌可改善肠道内微生物菌群的平衡，加速损伤肠黏膜的修复［7］，此外，益生菌还可通过增加紧密连接蛋白的表达以加固肠黏膜物理屏障［8］。DAO存在于肠黏膜上层绒毛细胞胞浆中具有高度活性的内酶，当肠黏膜细胞受损后DAO进入肠淋巴管和血液，导致血液中DAO活性增高，DAO是反映小肠黏膜结构功能较为敏感的指标［9-10］。肠黏膜屏障包括机械屏障、化学屏障、免疫屏障和生物屏障，机械屏障是非常重要的组成部分。完整的机械屏障由肠上皮、上皮细胞间紧密连接及上皮间质构成。紧密连接表达的改变可能是胆汁淤积时肠黏膜屏障损伤、通透性增加的重要的原因［11］。Occludin和ZO-1是上皮细胞间紧密连接结构的主要蛋白分子，Occludin通过胞膜外部分与相邻细胞发生结合而产生细胞旁封闭，ZO-1则在连接Occludin中起桥梁作用ZO-1起着装配平台作用，同时又是Occludin与胞内骨架系统连接及信号转导机制中的重要结构，对肠上皮起稳定作用［12］。本研究发现胆汁淤积大鼠的血清中DAO活性较正常大鼠明显升高，小肠中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的蛋白表达明显减少，表明胆汁淤积大鼠的肠黏膜屏障受到损伤，结构受到破坏，紧密连接表达减少。酪酸梭菌可降低胆汁淤积大鼠血清中DAO的活性，增加小肠中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的蛋白表达，说明酪酸梭菌可改善大鼠肠黏膜通透性，对肠黏膜屏障具有保护作用。

肠道菌群不仅在人体消化吸收、免疫应答等活动中发挥作用，其还作为肝-肠循环的重要媒介，与非酒精性脂肪性肝病、胆汁淤积、肝硬化、肝性脑病等密切相关［13］，直接或间接影响肝脏的功能。多项研究从益生菌改善肠道菌群、肠道屏障功能等机制方面证实［14-15］，益生菌确有改善患者肝脏功能的作用。本研究显示酪酸梭菌可降低胆汁淤积大鼠血清中ALT、AST的活性和T-BIL的含量，改善肝组织病理，表明酪酸梭菌具有改善胆汁淤积大鼠肝损伤的作用。

本研究创新之处为基于肝肠轴应用酪酸梭菌治疗胆汁淤积造成的肝损伤，并从肠黏膜通透性和紧密连接表达探索其作用机制，研究表明酪酸梭菌改善肝损伤的作用可能与其调节肠黏膜通透性、增加紧密连接蛋白表达有关，然而肝肠之间相互作用的途径复杂，酪酸梭菌是否也通过其他机制起到保护肝损伤的作用仍需进一步的研究。

［1］周建利，周少明，程勇卫，等.婴儿胆汁淤积性黄疸的病因、临床特点及转归分析［J］.实用医学杂志，2016，32（13）：2172-2174.

［2］FISCHLER B，LAMIREAU T.Cholestasis in the newborn and infant［J］.Clin Res Hepatol Gastroenterol，2014，38（3）：263-267.

［3］王晓玲，王江涛.更昔洛韦、酪酸梭菌联合使用对巨细胞病毒感染引起婴儿淤胆型肝炎综合征的治疗效果观察［J］.北方药学，2017，14（6）：34-35.

［4］CULLEN J M，FAIOLA B，MELICH D H，et al.Acute alpha-Naphthylisothiocyanate induced liver toxicity in germfree and conventional male rats［J］.Toxicol Pathol，2016 ，44（7）：987-997.

［5］张真玲，段志军.肠肝轴-肝病防治中的重要目标［J］.世界华人消化杂志，2016，24（23）：3454-3460.

［6］GOLBAR H M，IZAWA T，ICHIKAWA C，et al.Slowly progressive cholangiofibrosis induced in rats by α-naphthylisothiocyanate（ANIT），with particular references to characteristics of macrophages and myofibroblasts［J］.Exp Toxicol Pathol，2013，65（6）：825-835.

［7］EVERARD A，BELZER C，GEURTS L，et al.Cross-talk between akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controlsdiet-induced obesity［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（22）：9066-9071.

［8］DAI C，ZHAO D H，JIANG M.VSL#3 probiotics regulate the intestinal epithelial barrier in vivo and in vitro viathe p38 and ERK signaling pathways［J］.Int J Mol Med，2012，29（2）：202-208.

［9］LI H，QIU P，WANG J，et al.Effects of compound Ginkgo biloba on intestinal permeability in rats with alcohol-induced liver injury［J］.Food Funct，2015，6（2）：470-478.

［10］SUN T，GAO G Z，LI R F，et al.Bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation amelioratesoxidative stress and restores intestinal mucosal permeability in chemically induced colitis in mice［J］.Am J Transl Res，2015，7（5）：891-901.

［11］YIN J，WU M，DUAN J，et al.Pyrrolidine dithiocarbamate inhibits NF-KappaB activation and upregulates the expression of Gpx1，Gpx4，Occludin，and ZO-1 in DSS-induced colitis［J］.Appl Biochem Biotechnol，2015，177（8）：1716-1728.

［12］YU T，LU X J，LI J Y，et al.Overexpression of miR-429 impairs intestinal barrier function in diabetic mice by down-regulating occludin expression［J］.Cell Tissue Res，2016，366（2）：341-352.

［13］BELL D S.Changes seen in gut bacteria content and distribution with obesity：causation orassociation［J］.Postgrad Med，2015，127（8）：863-868.

［14］KOGA H，TAMIYA Y，MITSUYAMA K，et al.Probiotics promote rapid-turnover protein production by restoring gut flora inpatients with alcoholic liver cirrhosis［J］.Hepatol Int，2013，7（2）：767-774.

［15］BAJAJ J S，HEUMAN D M，HYLEMON P B，et al.Randomised clinical trial：Lactobacillus GG modulates gut microbiome，metabolome and endotoxemia in patients with cirrhosis［J］.Aliment Pharmacol Ther，2014，39（10）：1113-1125.