c-Jun氨基末端激酶通路在缺氧性肾小管上皮细胞转分化中的作用

江星伯 蒋玲 龚玲 宋坤岭 余雪云 覃远汉

广西医科大学第一附属医院儿科（南宁 530021）

肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）的关键因素和中心环节是肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cell，RTEC）损伤和功能不全［1］，缺氧是引起RIF发生发展的一个重要微环境因素，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activiated protein kinases，MAPK）超家族中的应激活化蛋白激酶（C-jun N-terminal kinase，JNK）可在缺氧条件下被激活［2］。有研究表明［3-5］，在肾小管损伤中存在大量JNK的激活，JNK可能在缺血缺氧损伤中发挥重要作用。α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是肌成纤维细胞（myofibroblast，MF）的标志性蛋白，RIF常出现肾脏固有细胞表型转分化，大量表达α-SMA，因此α-SMA的表达变化在RIF中具有重要意义。HONMA等［6］报道，肾脏组织的JNK蛋白的表达量与组织纤维化和肾功能不全呈正相关。JNK在体外培养的大鼠RTEC缺氧性损伤中对α-SMA的作用，国内尚未发现相关研究报道，为此我们通过检测JNK、pJNK和α-SMA在大鼠RTEC缺氧性损伤表达变化，初步探讨JNK通路在缺氧性RTEC转分化中的作用，为防治RIF提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料大鼠肾小管上皮细胞株（NRK-52E）购自上海生物细胞库。DMEM basic（1×）培养基、混合胎牛血清均购自美国Gibco公司，青、链霉素和JNK通路特异性阻断剂SP600125均购自碧云天公司，缺氧真空罐购自加拿大Stemcell公司，Trizol RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购自美国Thermo公司，FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）试剂盒购自德国 Roche公司，5×电泳液、10×电转液、20×TBS溶液、Tween-20均购自北京索莱宝公司，PVDF膜购自美国Immobilon-P公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，引物设计及合成均由宝生物工程（大连）有限公司完成，JNK抗体、pJNK抗体和β-actin抗体购自美国CST公司，α-SMA抗体购自美国Abcam公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国CST公司，Chemiluminescent HRP Substrate购自美国Millipore公司，FluorChem M购自美国Protein Simple公司，实时荧光定量PCR仪7500购自美国Applied Biosystems公司。

1.2 上皮细胞培养与缺氧损伤模型构建大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）培养在7%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，在37℃、50 mL/L二氧化碳（CO2）培养箱中培养，细胞生长至约70%融合时传代。待传代的细胞生长至对数期时，将细胞随机分为5组：正常组、缺氧组、抑制剂组、激动剂组、DMSO组。正常组在正常培养条件下继续培养，不予以缺氧损伤处理。抑制剂组加入含有JNK通路特异性阻断剂SP600125（10、20 μmol/L，溶于DMSO中）的DMEM培养基5 mL培养30 min后与缺氧组、DMSO组（加入含有与抑制剂等体积的DMSO的DMEM培养基5 mL）移入真空缺氧罐中进行缺氧性损伤处理［7］，分别于缺氧处理6、12、24 h后均复氧30 min，收集细胞进行分子生物学指标检测。

1.3 α-SMA mRNA表达检测采用RT-PCR法。按Trizol RNA提取试剂盒说明提取各组的总RNA，为减少误差，每组重复3次。按反转录试剂盒的说明要求选择符合条件的mRNA进行反转录。β-actin为内参进行RT-PCR，α-SMA上游引物：5′-CTCTTCCAGCCATCTTTCATT-3′，下游引物：5′-GCATTTGCGGTGGACAATGGA-3′，片段长度：342 bp。 β-actin 上 游 引 物 ：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，片段长度：124 bp。反应总体系20.0 μL：上、下游引物各0.8 μL，Mix 9 μL，模板 1.5 μL，ddH2O 7.9 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，循环1次，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，循环40次。每个样本设3个副孔，取其平均值为样本Ct值。以正常组的基因表达量为1，采用2-△△Ct法计算其余各组mRNA的相对表达量。变化倍数（Fold change）为各组较正常组基因的相对表达倍数。

1.4 JNK、pJNK、α-SMA蛋白表达检测采用Western blotting法。模型建立后，按放射免疫沉淀法（RIPA）蛋白裂解液说明书抽提各组RTEC总蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量分析法测定蛋白浓度。煮沸变性后取30 μg上样，进行Western Blotting。常温下十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），湿转法转膜至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），5%脱脂牛奶室温摇床封闭1 h，一抗JNK抗体（稀释度1∶1 000）、pJNK抗体（稀释度1∶1 000）、α-SMA抗体（稀释度1∶1 000）4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释度1∶2 000）常温孵育1.5 h，利用化学发光液在FluorChem M下，检测蛋白条带灰度值，以β-actin基因蛋白作为参照，以目的蛋白/内参蛋白作为蛋白的相对表达量，采用Alpha View软件对结果进行分析。

1.5 统计学方法采用SPSS 17.0软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差表示，多组间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组RTEC的 α-SMA mRNA表达变化与正常组比较，缺氧 6、12、24 h组 RTEC 的 α-SMA mRNA表达均显著增加（均P＜0.05），缺氧时间越长，α-SMA的mRNA表达越显著；与缺氧组相比，DMSO组RTEC的α-SMA mRNA表达改变差异均无显著性（均P＞ 0.05），抑制剂组（10、20 μmol/L）RTEC的α-SMA mRNA表达均显著降低（均P＜0.05）。见图1。

2.2 各组RTEC的JNK、pJNK和α-SMA蛋白表达变化与正常组比较，缺氧6、12、24 h组RTEC的pJNK、α-SMA蛋白表达均显著增加（P＜0.05），缺氧时间越长，JNK、pJNK和α-SMA蛋白的表达越显著；与缺氧组相比，DMSO组RTEC的JNK、pJNK、α-SMA蛋白表达差异均无显著性（均P＞0.05），抑制剂组（10、20 μmol/L）RTEC的pJNK、α-SMA蛋白表达均显著降低（均P＜0.05），JNK蛋白表达均显著增加（均P＜0.05）。见图2。

图1 各组细胞α-SMA mRNA表达数据水平Fig.1 Analysis of alpha-SMA expression in each group

图2 各组细胞JNK、pJNK和α-SMA蛋白条带图及数据分析Fig.2 Banding patterns and data analysis of JNK,pJNK and α-SMA in each group of cells

2.3 缺氧性RTEC损伤中pJNK蛋白表达与α-SMA蛋白表达的相关性分析在缺氧性RTEC损伤中，pJNK蛋白表达与α-SMA蛋白表达呈显著正相关（r=0.950，P＜ 0.01）。

3 讨论

RIF是导致多种急、慢性肾病终末期的主要原因和共同病理过程［8］，主要病理变化是细胞外基质的代谢失衡。本课题组的前期研究显示，在RIF中肾脏组织的α-SMA呈现高表达［9］。许春杰等［10］报道，肝纤维化中α-SMA出现高表达。缺血缺氧应激状态下，肾小管上皮细胞为适应微环境的改变，发生细胞表型的转分化，由上皮细胞转分化为肌成纤维细胞，同时加重局部炎症反应，增加致纤维化因子的表达，α-SMA则是这种表型转分化的标志蛋白［11］，转分化形成的肌成纤维细胞不断增加引起的细胞外基质沉积、代谢紊乱是引起RIF的关键因素之一［12］。因此，研究肾小管上皮细胞转分化的机制对防治RIF具有重要意义。

JNK是一种可以有效磷酸化c-Jun氨基末端的唯一的蛋白激酶，又叫应激激活蛋白激酶（SAPKs），属于进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是MAPKs超家族成员之一［13］。JNK通路可被多种应激刺激（如紫外线、高渗、缺血缺氧等）、细胞因子、生长因子以及某些G蛋白偶联受体激活，其基因可以编码46和55 kD两种蛋白产物，通过选择性剪接形成10种剪接变体［14］，在不同组织发挥不同的功能及作用。有研究表明，JNK通路与组织纤维化中细胞的转分化作用有密切联系。ZHAO等［15］报道，在成纤维细胞转分化的过程中，JNK在其中起到调控作用。KLUWE等［16］认为，JNK参与了肝纤维化中转分化过程和纤维生成，其可能成为抗纤维化治疗的潜在靶标，以上研究提示JNK参与了组织纤维化中的转分化过程。

本研究通过建立缺氧性RTEC损伤模型，于缺氧后6、12、24 h分别检测细胞的α-SMA的mRNA表达，JNK、pJNK和α-SMA的蛋白表达。结果显示，缺氧使细胞的pJNK蛋白表达显著增加，缺氧时间越长，活化JNK蛋白表达越高，同时α-SMA m-RNA和蛋白表达也显著增加，高α-SMA表达提示RTEC表型转分化不断加重，提示在缺氧条件下，缺氧时间越长，缺氧诱导磷酸化的JNK越多，通路激活程度越高。相关性分析显示RTEC中的pJNK蛋白表达与α-SMA蛋白表达呈显著正相关。加入JNK通路特异性阻断剂后细胞的JNK蛋白表达增加，pJNK蛋白表达均显著减少，pJNK蛋白表达/JNK蛋白表达减少。抑制剂浓度增加时，JNK蛋白表达增加越显著，pJNK蛋白表达和pJNK蛋白表达/JNK蛋白表达减少越显著，同时抑制JNK通路后，α-SMA的m-RNA和蛋白表达均显著降低，提示抑制JNK通路的活化后，减少RTEC发生表型转分化，因此α-SMA的表达减少，JNK通路被抑制的程度越高，α-SMA的表达越低。与缺氧组相比，DMSO组各项指标均没有显著差异，提示用于溶解SP600125的DMSO并没有参与RTEC缺氧性损伤。综上所述，在大鼠RTEC缺氧性损伤中，JNK通路可能参与了RTEC表型转分化作用。本研究虽然初步讨论了JNK通路在缺氧性RTEC转分化中的作用，但并未能明确其具体分子机制，同时与JNK通路相关的其他通路在RTEC转分化中的作用如何，仍需进一步的研究证实。

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