外周血间充质干细胞联合可吸收明胶海绵-自聚合肽修复大鼠股骨髁缺损

张志明 刘椿 伍国锋 曹延林 金扬磊 王一涵 郭家松 朱立新

1南方医科大学第二附属医院（珠江医院）骨科中心（广州510280）；2荆州市第一人民医院（长江大学第一附属医院）骨科（湖北荆州434000）；3南方医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室（广州510515）

尽管传统的治疗大块骨缺损的方法如自体骨移植、同种异体骨移植等取得了较好的临床效果，但这些方法均不同程度地存在一定缺陷，如自体骨移植来源困难、供区长期慢性疼痛，同种异体骨移植具有无法避免的免疫排斥反应及长期服用免疫抑制剂所带来的并发症等［1］。因此，研制一种具有高效、低副作用的骨缺损修复材料具有重大的临床价值。骨组织工程作为近年来治疗骨缺损的方法之一，与传统技术相比，具有取材来源广泛，不易引起排异反应等优点，因而成为从事骨组织工程研究的学者们近年来研究的热点［2］。虽然目前骨组织工程研究有了很大的进展，但是若将其广泛用于临床，仍有很多问题急需解决。如何获取合适的种子细胞和支架材料仍旧是骨组织工程研究的重点。因此，本研究以外周血间充质干细 胞（peripheral blood mesenchymal stem cells，PBMSCs）为种子细胞，多孔明胶海绵（absorbable gelatin sponge，AGS）、自聚合肽（self assembling peptide，SAP）的复合物为新型支架材料，使PBMSCs在AGS/SAP复合支架材料中的微环境类似于体内真实的三维生长环境，并且研究该新型复合组织工程材料在修复大鼠股骨髁骨缺损中的实际效果，为骨组织工程进一步发展提供新思路，为骨组织工程临床应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂SAP（Corning）；AGS；雌性SD大鼠，体质量200～300 g（南方医科大学实验动物中心）；青霉素钠［北京悦康凯悦制药有限公司，0.48 g（80 万 U）/支］，戊巴比妥钠（Sigma），EDTA脱钙液（LEAGENE）。

1.2 研究方法

1.2.1 多孔可吸收明胶海绵的制备由本研究团队所在医院骨科中心提供，将多孔可吸收明胶海绵制作成直径4.0 mm、高5.0 mm的圆柱状。采用的消毒方式如下：95%、75%酒精依次浸泡30 min，PBS洗涤3次，紫外线照射下自然干燥后无菌条件下密封保存备用。

1.2.2 PBMSCs的分离及培养以文献所述方法［3］分离、培养人体外周血干细胞的方法为参考，分离SD大鼠外周血间充质干细胞，调节细胞浓度为6×106个/mL并接种于3 cm培养皿中，置于37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养，待贴壁细胞融合度达80%左右，用0.05%胰蛋白酶消化传代培养。

1.2.3 PBMSCs的鉴定、体外多向诱导及染色、在复合支架材料中成骨诱导取P3 PBMSCs进行流式细胞术鉴定外周血来源的间充质干细胞的细胞表型。同时进行多向诱导染色。将PBMSCs接种于爬片上，分别加入成骨、成脂诱导液，每孔300 μL，每3天换液1次，连续诱导14 d，进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、油红O（oil red O，ORO）染色观察。同时用P3 PBMSCs构建体外AGS/SAP/PBMSCs培养模型。成骨诱导21 d，多聚甲醛固定，冰冻切片后进行骨钙蛋白、DAPI染色观察。

1.2.4 股缺损模型的制备及材料植入按文献报道［4］的方法在分组后的SD大鼠左侧股骨髁制备直径4 mm，深度为5 mm的缺损模型，随后按预先分组植入复合支架材料。术后予10万U青霉素腹腔注射，1次/d，连续3 d。

1.2.5 影像学、组织学检测术后12周取材，将标本进行X线检查、Micro-CT扫描，观察骨缺损修复情况，计算缺损区域的新生骨的骨密度（BMD）［5］。随后彻底脱钙，制备厚度为5 mm的石蜡切片，采用苏木精-伊红染色，镜下观察并拍照。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行数据统计分析，统计数据用均值±标准差表示，3组间影像学评分采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著差异法检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代细胞的形态、鉴定及诱导分化在原代培养皿中发现大量贴壁的长梭形细胞；传代2次后，细胞形态均一（图1A）。流式细胞术鉴定的结果（图2）显示，符合间充质干细胞的表型特点。PBMSCs成骨诱导染色结果显示细胞广泛表达ALP（图1B）；PBMSCs成脂诱导后经ORO染色可见细胞内充满大量的红色脂滴（图1C）。说明最后所得的细胞 是外周血 间充质干 细胞，且具 有多向分化的潜能 。AGS/SAP支架中PBMSCs经过21 d成骨诱导后 ，骨钙蛋 白染色（ 图3、4） 提示已经 有大量PBMSCs被成功诱 导为成骨 细胞，说 明AGS/SAP复合支架不 影响PBMSCs生长、成骨 分化，可 作为组织工程支 架材料。

图1 PBMSCs形态、成骨与成脂诱导及鉴定Fig.1 Morphology of culture PBMSCs and identification of induced cells

图2 流式细胞术鉴定PBMSCs表型Fig.2 Cell phenotypes of PBMSCs measured by flow cytometry

图3 AGS、AGS/SAP支架及AGS/SAP/PBMSCs扫描电镜观察(scanning electron microscope,SEM)Fig.3 Structures of AGS scaffolds measured by SEM

图4 PBMSCs在AGS-SAP支架中成骨诱导Fig.4 Cultured PBMSCs induced into osteoblasts in the AGS/SAP scaffolds

2.2 影像学检查通过X线检测（图5），发现实验组骨缺损处与正常股骨髁骨相近，而空白对照组和单纯支架对照组仍可见明显骨缺损；Micro-CT（图6）可见实验组（C1，C2）骨缺损基本修复，而空白对照组（A1，A2）和纯支架对照组（B1，B2）仍可见大块未修复的骨缺损存在。BMD结果（图7）如下：空白对照组组为609.9±27.3，纯支架对照组为647.3±33.7，实验组为708.6±25.4，3组之间的差异有统计学意义（P＜0.01）。结合以上结果，说明AGS/SAP/PBMSCs具有较好的骨缺损修复效果，可以用于大鼠股骨髁缺损的治疗。

图5 骨缺损X片图Fig.5 Bone defects been X-rayed

图6 骨缺损Micro-CTFig.6 Bone defects scanned by Micro-CT

2.3 HE染色HE染色结果见图8，空白对照组在股骨髁缺损周围边缘处有较少不规则新生骨组织形成，由边缘向中心生长；纯支架对照组骨缺损外围存在部分新生骨，与骨组织类似，但在填充区域可见较多未降解的支架材料及散在极少量的骨组织细胞；骨缺损处新生骨组织与周围正常骨组织相连。HE染色结果显示，SAP/AGS复合PBMSCs可用于修复骨缺损的治疗，经12周修复，缺损处的新生修复骨组织形态结构逐渐与周围正常骨组织接近。

3 讨论

利用骨组织工程修复各种原因所致的大块骨缺损有很大前景。骨组织工程应具备三要素：种子细胞、支架材料和生长分化因子［6］。如何获取合适的种子细胞是骨组织工程的首要环节，其次是制备具有机械性能高，生物相容性好，细胞毒性低的生物材料［7-8］。

图7 各组BMD统计结果Fig.7 BMD statistical results of 3 groups

种子细胞应该具有取材容易、来源广泛、易于体外扩增培养的特点。本研究采用PBMSCs作为种子细胞，不仅具备上述特征，而且对供者自身几乎无不良影响，同时不涉及社会、道德伦理等方面的争议。避免了其他干细胞，在获取过程中所面临的如组织损伤、局部感染和伦理道德等问题。因此PBMSCs有望成为一种新的、广泛用于未来骨组织工程的种子细胞。

图8 HE染色显示各组骨缺损修复结果Fig.8 Regeneration of bone defects measured by HE stain

AGS是由明胶分子聚合而成的具有网丝状微孔结构聚合物，AGS的微孔大小均匀、形状规则，对小分子物质及细胞的吸附作用强，可以为细胞各项功能的发挥提供一个最佳的微环境，同时也能够为骨的形成提供空间［9］。而且明胶海绵具有良好的组织相容性，可自行吸收，来源广泛，取材方便的优点，目前已广泛应用于临床，尤其在骨科临床手术中。自聚合肽纳米纤维支架（self assembling peptide，SAP）遇钙、镁等离子立即立即自聚合形成的水凝胶具有低免疫源性、生物可降解性、纳米复合性以及与细胞外基质高度相似性等特点［10］，同时可为细胞提供真实的三维生长环境，它已成功用于多种组织工程的研究［11-13］。

本研究采用的AGS/SAP/PBMSCs移植材料，通过对SD大鼠股骨髁缺损的修复实验，证实了AGS/AP/PBMSCs对骨缺损具有较好的修复效果。它的成骨修复效果一方面与复合组织工程支架材料及PBMSCs有关，同时由于该支架材料改变了PBMSCs在支架中的生存环境，从而更接近于细胞的真实生存环境，进而更加有利于成骨细胞成骨；另一方面可能是由于细胞生存环境的改变，进一步激活了细胞的某种机制，从而进一步促进了成骨修复效果。

综上所述，本课题组将AGS/SAP/PBMSCs植入SD大鼠股骨髁缺损，通过一系列检测，发现AGS/SAP/PBMSCs比空白组、AGS/SAP组有更好的骨缺损修复能力。从而说明了基于AGS/SAP的三维立体支架材料复合PBMSCs，更能有效促进SD大鼠股骨髁缺损的修复，为临床上骨缺损修复提供新的思路及实验依据。但本研究的不足之处在于，未对因细胞生长微环境的变化而导致的细胞机制的相应变化进行深入的研究，这将是我们后期研究的重点。

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