多种统计方法比较黄连姜制工序中影响生物碱含量的因素＊

王 鑫，袁金凤，彭诗涛，张语凡，王 蕾，张先灵，李 飞

（北京中医药大学中药学院 北京 102488）

黄连为毛茛科植物黄连（Coptis chinensis Franch.）、三角叶黄连（Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao.）、云连（Coptis teeta Wall.）的干燥根茎。黄连生品味苦、性寒；具有清热燥湿、泻火解毒的作用[1]。姜黄连为黄连的炮制品之一，姜炙后可缓和生品的苦寒之性，善治胃热呕吐。历版药典和各地炮制规范[2-15]中姜黄连的炮制工艺不尽相同。其中辅料姜汁的制备工艺有榨生姜汁、煮干姜汁、煮生姜汁；辅料姜汁与黄连饮片有拌匀吸尽和润至透心的不同。生姜味辛性温，具有温中止呕，解表散寒之功；干姜性热，长于温中散寒，回阳通脉，有学者认为四川干姜为真正的“药姜”，不同姜汁对黄连生物碱的影响未见报道。故本研究选择生姜、四川干姜、同批次生姜切片晒干制得的干姜制备姜汁。由于传统炙法全凭操作者的主观判断，不易量化，部分学者采用烘法替代炙法，两种加热方式对姜黄连的质量影响是否一致尚不明确，故采用文献[16]报道的姜黄连最优烘制工艺，对传统炙法和烘法进行比较。本实验通过查阅历版药典和各地炮制规范，发现姜炙法中姜汁的制备、闷润节点等工序中各地各法，无规范化的炮制工艺，不能明确各工序中影响饮片质量的因素。这些问题的存在，使得姜黄连饮片的质量很难达到稳定、可控，不能保证临床用药的安全、有效。故本研究采用同批次黄连片制备姜黄连，在2015版《中国药典》规定的4种生物碱含量标准的基础上，以6种生物碱含量作为评价指标，比较不同方法制备的姜汁、闷润程度、姜的来源、加热方式对黄连生物碱含量的影响，并采用多种统计方法进行分析，寻找姜制工序中影响姜黄连质量的因素，旨在为姜黄连炮制工艺及质量标准的完善提供依据。

表1 黄连炮制品的制备及外观性状

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪（2489紫外检测器，Empower色谱工作站）；SB25-12DTDN型超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；SHB-3型循环多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；BT-25S型电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；AR882+型在线式红外测温仪（深圳市富兰克仪器仪表有限公司）。

1.2 试药

盐酸药根碱（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：ST03080120MG，纯度≥98%）；非洲防己碱（上海源叶生物科技有限公司，批号：W30M7Z15501，纯度≥98%）；表小檗碱（批号：PRF8041721，纯度≥98%）、盐酸黄连碱（批号：PRF7091402，纯度≥98%）、盐酸巴马汀（批号：PRF8030248，纯度≥98%）、盐酸小檗碱（批号：PRF8040742，纯度≥98%）均购自成都普瑞法科技开发有限公司。乙腈（美国Fisher公司，色谱纯），其余试剂均为分析纯。

黄连购于北京市双桥燕京中药饮片厂，产地为湖北，批号：1604084。经北京中医药大学中药学院杨瑶珺教授鉴定为毛茛科植物黄连（Coptis chinensis Franch）根茎切成的饮片；干姜购于北京市双桥燕京中药饮片厂，产地为四川，批号：1603060；生姜购于本地农贸市场。

2 方法与结果

2.1 炮制品的制备

黄连：取黄连饮片，净制备用，得生品1。

姜汁的制备：分别取生姜、同批次生姜切片晒干制得的干姜（以下简称“干姜”）、四川干姜制备姜汁。三种辅料姜汁的制备方法如下：①榨生姜汁：按2015版《中国药典》炮制通则制备[1]；②煮干姜汁：按1988年版《全国中药炮制规范》炮制通则制备[3]；③煮生姜汁：按1990年版《山东省中药饮片炮制规范》炮制通则[7]制备。即得不同方法制备的辅料姜汁，备用。

姜制品的制备方法：①姜汁润炙品的制备[3]：取黄连片，加入姜汁拌匀，闷润至透，文火加热（温度为95-105℃），炒干；②姜汁拌炙品的制备[1]：取黄连片，加姜汁拌匀至吸尽，置热锅内，文火（温度为95-105℃）炒干；③姜汁拌烘品的制备[16]：取黄连片与生姜汁拌匀，闷润60 min后于100℃下烘制3 h。对各个样品进行炮制后，观察其性状（表1）。

上述炮制品所用的黄连生品均来自同一批次，并在相同温度下炒干。在姜制品的炮制方法上，主要以1988年版《全国中药炮制规范》的润炙方法为主。同时，以姜汁拌炙品为对照比较加辅料润透及吸尽有无区别；以川姜汁润炙品比较不同来源的姜所制姜汁有无区别；以清水润炙品为对照比较加与不加姜汁的黄连润炙品有无区别；以姜汁拌烘品为对照比较加热方式对黄连姜炙品的影响。分别将上述炮制品粉碎，过2号筛，备用。

2.2 生物碱含量测定[17]

2.2.1 色谱条件

XtimateTMC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为30 mmol·L-1碳酸氢铵水溶液（每1 L碳酸氢铵溶液7 mL氨水及1 mL三乙胺），B相为纯乙腈，线性梯度洗脱程序为0-15 min，10-25%B；15-25 min，25-30%B；25-40 min，30-45%B；流速为1 mL·min-1；检测波长为270 nm；柱温为30℃；进样量为10 μL。在上述色谱条件下，理论塔板数按盐酸药根碱、盐酸非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰计算均不低于10 000。分离度符合含量测定要求。空白对照品、混合对照品及样品色谱图见图1。

2.2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取盐酸药根碱、盐酸非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱10.44、10.35、9.45、9.39、7.99、9.04 mg，分别置于 10、10、50、25、25、25 mL量瓶中，用甲醇-盐酸溶液（100∶1）溶解并稀释至刻度，即得各对照品储备液。

分别吸取上述对照品储备液盐酸药根碱0.5 mL、盐酸非洲防己碱0.5 mL、盐酸表小檗碱5.5 mL、盐酸黄连碱5.0 mL、盐酸巴马汀4.5 mL、盐酸小檗碱18.5 mL于50 mL量瓶中，用甲醇-盐酸溶液（100∶1）定容至刻度（与储备液一致），即得混合对照品储备液。

2.2.3 供试品溶液的制备

将制备好的样品粉末混合均匀，取供试品粉末约0.1 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸溶液（100∶1）50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率：250 W，频率：40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇-盐酸溶液（100∶1）补足减失的重量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.4 线性关系考察

分别精密量取混合贮备液0.5、1.0、2.5、5、10 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇-盐酸溶液（100∶1）稀释至刻度，即得不同浓度的系列混合对照品溶液，分别精密吸取混合对照品储备液及上述混合对照品溶液各10 μL，按上述色谱条件进行测定，以峰面积积分值（Y）对各生物碱浓度（mg·L-1）（X）进行线性回归绘制标准曲线。盐酸药根碱：Y=3.06×107X-7 858.90，r=0.999 9；盐酸非洲防己碱：Y=4.11×107X-898.49，r=0.999 8；盐酸表小檗碱：Y=5.17×107X-24 177，r=1.000 0；盐酸黄连碱：Y=3.89×107X-41 610，rr=0.999 9；盐酸巴马汀：Y=4.29×107X-20 112，r=1.000 0；盐酸小檗碱：Y=4.14×107X-84183，r=1.000 0。结果表明，上述生物碱分别在0.004 4-0.087 3、0.010 2-0.204 1、0.018 0-0.360 6、0.014 4-0.287 6、0.066 2-1.323 5 μg进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液，在上述色谱条件下重复进样6次，记录6种生物碱峰面积。计算得盐酸药根碱、盐酸非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为2.2%，2.8%，1.8%，2.4%，2.4%，1.9%。表明仪器精密度良好。

图1 空白对照品（A）、混合对照品（B）、姜黄连样品（C）的液相色谱图

2.2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，室温放置，分别在0、2、4、8、12、24 h各进样一次，记录6种生物碱峰面积。计算得盐酸药根碱、盐酸非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积RSD分别为2.4%、2.3%、2.8%、2.1%、1.6%、1.5%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验

取黄连生品粉末，精密称定6份，按照2.2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下进行测定。盐酸药根碱、盐酸非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积RSD分别为2.2%、2.8%、1.8%、2.4%、2.4%、1.9%，重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验

取已知含量的黄连生品粉末6份，每份0.05 g，精密称定，分别精密加入一定量的生物碱混合对照品储备溶液，按2.2.3项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件定量测定。盐酸药根碱、盐酸非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的平均回收率分别为97.37%、98.81%、98.03%、102.10%、96.80%、101.42%，RSD分别为2.22%、1.43%、1.59%、1.31%、0.85%、1.63%。

2.2.9 样品测定

取黄连及各炮制品粉末，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进行测定，外标法计算样品含量，样品测定结果见表2。

由表2可知，黄连经姜炙后，表小檗碱、黄连碱含量略有上升，药根碱、非洲防己碱、巴马汀、小檗碱含量略有下降。在6种生物碱含量上，传统姜炙品均高于烘制品。

表2 黄连及各炮制品中6种生物碱的含量（n=3）

表3 黄连姜制品的特征根和方差贡献率

表4 黄连姜制品的主成分向量

图2 黄连及各炮制品样品聚类图

2.3 数据处理

2.3.1 主成分分析

以6种生物碱为指标，将黄连姜制品数据输入SAS 9.3进行主成分分析，相关系数的特征值和方差贡献率见表3，各主成分对应的特征向量见表4。

由表3可以看出：第1、2、3的主成分的累计方差贡献率为96.79%＞85%。故选择前3个主成分进行评价。它代表了姜黄连中6种生物碱信息量的96.79%。由表4可知，根据主成分所对应的特征向量，可得前3个主成分的表达式为：

由此可见，第一主成分Z1主要受表小檗碱（X3）的影响，第二主成分Z2主要受非洲防己碱（X3）的影响，第三主成分Z3主要受药根碱（X1）的影响。黄连经姜制后各生物碱含量略有变化，经主成分分析，不同姜制品之间生物碱含量的差异主要体现在各样品所含表小檗碱、非洲防己碱、药根碱含量的不同，故以6种生物碱含量评价姜黄连质量具有一定科学性。

2.3.2 聚类分析

以6种生物碱的均值为指标，采用SAS 9.3分层聚类分析软件对样品进行聚类分析，运用欧氏距离（Euclidean）作为样品的测度，结果见图2。

由图2可知，当欧氏距离λ=4时，烘法和传统炙法具有明显不同的聚类，说明烘品与炙品不同，这可能与加热方式有关；λ=2时，生品和清水炙品为一类，姜炙品为一类，说明辅料姜汁的加入对黄连产生影响，加辅料与不加辅料是有区别的。

2.3.3 LSD检验

以6种生物碱之和为指标，采用LSD检验对生品及姜制品进行两两比较，各组数据均符合正态且方差齐。在多个样本均数比较的方差分析中，F=6.28，P=0.000 7，P＜0.05认为差异有统计学意义，总体均数不全相等。多个样本均数间的多重比较见表5。

表5 黄连及姜制品中6种生物碱之和的多重比较

由表5可知，烘法与炙法具有显著性差异，而采用传统炙法炮制的姜炙品之间无显著性差异。加热方式可能是影响姜黄连生物碱含量的主要因素，而用不同方法制备的姜汁对姜黄连的6种生物碱之和影响不大，该结果与聚类分析的结果一致。

2.3.4 独立t检验

为了更好的比较榨汁组“姜汁拌炙品”与“姜汁润炙品”有无区别，选择独立t检验对各生物碱进行两两比较，结果见表6。

表6 两组姜黄连中各生物碱的独立t检验

由表6可见，各生物碱的P值均大于0.05，无显著性差异。在辅料姜汁与黄连饮片拌润的工序中，姜汁与黄连饮片“拌匀吸尽”或“润至透心”在6种生物碱含量上没有区别，该结果与聚类分析及LSD检验的结果一致。

3 总结与讨论

3.1 闷润工序中加水量的确定

黄连在姜炙时，饮片与姜汁闷润至透心，其液体辅料稀释时的加水量没有明确规定。为保证实验结果的准确性和可重复性。对闷润工序中的加水量进行考察，即：取适量黄连饮片，重量为M，加适量水V1浸泡，待饮片全部润透，内无干心时，过滤，未被吸收的水为V2。则饮片吸水率为：

重复3次，黄连饮片的平均吸水率为50%，即1 kg黄连饮片吸收的液体量大约为500 mL。根据黄连饮片吸水率测定的结果，量化出其“闷润至透心”时的加水量，以保证水的加入对黄连影响的一致性。

3.2 辅料姜的来源对姜黄连生物碱的影响

有学者认为四川干姜为真正的“药姜”，本实验对四川干姜和生姜晒干姜进行比较，聚类分析与LSD检验均表明两种姜汁制备的姜黄连在6种生物碱含量上无显著性差异。

3.3 小结

本实验采用同一批次黄连炮制样品，姜炙法达到传统质量要求的炒干程度时，润炙法所需时间较拌炙法长，但外观性状一致，均符合“表面棕黄色，略有姜的辛辣味”。烘制法炮制的姜黄连颜色较炙法颜色加深，姜辣味淡，焦香气浓。本研究采用聚类分析、LSD检验、独立t检验对6种生物碱含量进行分析，结果表明烘制品与传统炙品具有明显差异，烘制品的6种生物碱总量较姜炙品下降10%左右；而传统炙法中姜的种类、不同方法制备的姜汁及闷润程度对姜黄连的6种生物碱含量影响不大。鉴于炒炙温度控制在95-105℃，烘制温度为100℃，两种加热方式温度基本一致，外观性状与成分的差异可能与烘制时间长达3 h有关。在没有更多科学依据之前，仍应采用传统的姜炙方法制备姜黄连。考虑到若加入姜汁润至透心，则因需加水量大稀释姜汁，炒干需要的工时长，故在加入辅料工序中，辅料姜汁与黄连饮片拌匀吸尽即可。

1 国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部).北京:中国医药科技出版社,2015:31.

2 辽宁省卫生局.辽宁省中药炮制规范.沈阳:辽宁省卫生局,1975:48.

3 卫生部药政管理局.全国中药炮制规范.北京:人民卫生出版社,1988:96,113.

4 江西省卫生厅药政管理局.江西省中药炮制规范.上海:上海科学技术出版社,1991:106.

5 江苏省卫生局.江苏省中药饮片炮制规范.南京:江苏科学技术出版社,1980:105.

6 吉林省卫生厅.吉林省中药炮制标准.长春:吉林科学技术出版社,1987,32.

7 山东省卫生厅.山东省中药炮制规范.济南:山东科学技术出版社,1990:76.

8 安徽省食品药品监督管理局.安徽省中药饮片炮制规范.合肥:安徽科学技术出版社,2005:98.

9 浙江省食品药品监督管理局.浙江省中药炮制规范.杭州:浙江科学技术出版社,2005:124.

10 河南省食品药品监督管理局.河南省中药饮片炮制规范.郑州:河南人民出版社,2005:118.

11 贵州省食品药品监督管理局.贵州省中药饮片炮制规范.贵州:贵州科技出版社,2005:222.

12 广西壮族自治区食品药品监督管理局.广西壮族自治区中药饮片炮制规范.南宁:广西科学技术出版社,2007:314.

13 北京市药品监督管理局.北京市中药饮片炮制规范.北京:化学工业出版社,2008:226-227.

14 江西省食品药品监督管理局.江西省中药饮片炮制规范.上海:上海科学技术出版社,2008:135.

15 湖南省食品药品监督管理局.湖南省中药饮片炮制规范.长沙:湖南科学技术出版社,2007:57.

16 王德珍,易骏,张翼,等.酒黄连、姜黄连、萸黄连最佳炮制工艺研究.中药材,2013,36(1):35-37.

17 耿志鹏,郑海杰,张艺,等.RP-HPLC测定不同产地黄连中6种生物碱的含量.中国中药杂志,2010,35(19):2576-2580.