保元排毒丸对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏Wnt/β-catenin信号通路的影响＊

王身菊，朱美凤，郑宏香，张 玲，陈 岱

（南京中医药大学附属常州市中医医院 常州 213000）

据流行病学调查结果[1]显示，我国年龄18岁以上的成人慢性肾脏病（CKD）的患病率为10.8%，据此估算中国现有CKD患者达到1.2亿。CKD的发病率和病死率逐年升高，目前CKD已成为全球急待解决的健康问题[2]。肾间质纤维化（Renal interstitial fibrosis RIF）的严重程度能判断肾功能受损害程度，对CKD的预后有决定性作用。延缓和防治肾纤维化是防治慢性肾脏病进展的关键。本课题组在以往的临床实践中，采用纯中药制剂保元排毒丸（保元排毒丸由生黄芪、黄精、生晒参、冬虫夏草、生大黄、六月雪、接骨木、丹参、陈皮、六神曲、木灵芝）治疗CKD患者，取得了较满意的临床疗效[3-5]。本实验通过制作UUO大鼠肾脏纤维化模型，观察保元排毒丸对UUO模型大鼠肾脏病理的影响及对Wnt/β-catenin信号转导通路的调控，以探讨保元排毒丸延缓肾纤维化的机理。

1 材料

1.1 实验动物

清洁级健康雄性SD大鼠48只，7-8周，体质量190±8 g，购自南京医科大学实验动物中心，动物生产许可证号码SCXK(苏)：2016-0002。进食标准普通饲料，自由饮水，日常光照。适应性饲养3天后进入实验。

1.2 实验药品

保元排毒丸（药物批号160902）来源于南京中医药大学附属常州市中医医院制剂室。制作工艺：取生黄芪、黄精、生晒参、冬虫夏草、陈皮、黄精、六神曲、半量的生大黄共7味中药混合研成细粉过80-100目筛备用；另取丹参、六月雪、木灵芝、接骨木及半量生大黄及上述各药的粗粉共加水煎煮二次，第一次1.5 h，第二次1 h，合并滤液，静置，取上清液浓缩至相对密度为1.01以上备用。取上述粉末用浓缩液泛丸，丸粒制成梧桐子大小，整粒，60-80℃热风循环干燥即得。每丸重0.14 g，相当于生药含量0.38 g。厄贝沙坦（商品名：安博维），由赛诺菲杭州制药有限公司生产，规格150 mg/片。

1.3 主要试剂

苏木素-伊红染液（武汉谷歌生物科技有限公司货号G1005）、Masson染色试剂盒（武汉谷歌生物科技有限公司 货号G1006），DAB显色试剂盒（DAKO）；TRIS（Solarbio T8060），Trizol Reagent、BCA蛋白定量检测试剂盒及SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（武汉塞维尔生物科技有限公司），兔源性E-cadherin抗体（三鹰公司，货号20874-1-AP），兔源性Ⅰ型胶原抗体（三鹰公司，货号14695-1-AP），兔源性β-catenin抗体（servicebio，GB11015）；兔源性β-actin（servicebio GB13001-1）。引物设计合成（武汉擎科创新生物科技有限公司），Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo K1622）、Fast Start Universal SYBR Green Master(Rox)（Roche 04 913 914 001）、HyPure TMMolecular Biology Grade Water（HyClone SH30538.02）。

1.4 主要仪器

JJ-12J型脱水机、JB-P5包埋机（武汉俊杰电子有限公司）、烤箱、RM2016病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）、Nikon Eclipse CI正置光学显微镜。752-P紫外分光光度计（上海现科仪器有限公司）、neofuge 15R冷冻离心机（heal force）、DYY-6C电泳仪（北京六一仪器厂）、alphaEaseFC灰度分析软件（Alpha Innotech）、Stepone plus荧光定量PCR仪（ABI）、多样品研磨珠均质仪（Omni）。

2 方法

2.1 分组及UUO大鼠模型建立

48只清洁级健康雄性SD大鼠，按随机数字表随机分六组：假手术组、UUO组、厄贝沙坦组和保元排毒丸低、中、高剂量组，每组8只。除假手术组外，其余各组均按文献[6]方法造模。以3%戊巴比妥钠，按照0.2mL/100g腹腔注射麻醉，麻醉成功后，固定大鼠，剃去右背部毛发，暴露皮肤，聚维酮碘消毒皮肤3遍，铺无菌手术巾。在距脊柱约1-1.5 cm，肋缘下做长约1-1.5 cm纵行切口，逐层剥离皮下筋膜，切开肌肉，暴露出肾盂及输尿管，玻璃分针分离出右输尿管，近肾盂处结扎输尿管两次，从两结扎中间剪断输尿管，后逐层缝合，关闭腹腔，以聚维酮碘消毒皮肤切口，用无菌敷料覆盖包扎。假手术组只分离右输尿管，不结扎，然后逐层缝合。

2.2 给药

将保元排毒丸溶于蒸馏水中，分别配成浓度为25%、12.5%、6.25%的溶液，放置冰箱冷藏以备用。造模第2天开始给药，共灌胃14天。保元排毒丸低、中、高剂量组分别给予保元排毒丸1.25g·kg-1/天、2.5g·kg-1/天、5.0g·kg-1/天；厄贝沙坦组：给予厄贝沙坦12.5g·kg-1/天；假手术组和UUO组给予自由进食及等容积生理盐水灌胃。大鼠给药剂量参照文献[7]，低剂量设为平均临床等效剂量，中、高剂量分别相当于平均临床等效剂量的2倍和4倍。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 肾组织病理

于末次灌胃禁食不禁水24 h后按前法麻醉取右肾，剔除包膜，用无菌纱布吸干水份，电子天平称取右侧肾脏湿重后，纵切一半右肾置于4%多聚甲醛中固定；右肾另一半分装于EPP管中于-80℃保存，待进一步检测。固定24 h后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，切4.0 μm薄片。按试剂盒方法进行HE、Masson染色，显微镜下观察肾脏病理学改变。HE染色肾小管间质损伤按Banff分级进行0-3级半定量计分。记录连续不重叠的10个200倍视野的数值，取其平均值比较每例切片的肾小管间质区域病变的程度。Masson染色半定量统计肾间质纤维化情况。在光学显微镜200倍高倍镜下连续观察每张切片不重叠的10个视野，计算出每个视野下肾间质苯胺蓝染色面积占整个视野的比例，记录每张切片的数值后取其平均值来比较各组肾间质纤维化情况。

2.3.2 Western Blot法测肾组织E-cadherin、Collagen I、β-Catenin表达水平

取保存于-80℃的肾组织，用冷PBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器，加入适量裂解液后冰上彻底匀浆。1 500 g离心10 min，收集上清，即为总蛋白溶液，BCA法测蛋白浓度。每上样孔加4 μg总蛋白行10%SDS-PAGE胶电泳。湿转法电转移至PVDF膜，用封闭液封闭1-2 h后，各组分别加入适当稀释后的 E-cadherin（1∶2000）、Collagen I（1∶1 000）、β-Catenin（1∶1 000）抗体4℃过夜。辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗用TBST稀释3 000倍，室温孵育30 min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5 min，化学发光剂ECL反应5 min，曝光，扫描蛋白条带，将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析以所测得的各指标吸光度与内参照β-actin吸光度的比值代表定量值。

图1 各组大鼠肾组织HE染色（×200）

2.3.3 Real-time PCR检测Wnt4、β-catenin mRNA表达

Wnt4、β-catenin的引物设计合成由武汉擎科创新生物科技有限公司完成。引物序列：WNT4：正义链5′-GGA AGG TGG TGA CAC AAG GGA-3′，反义链5′-CAT AGG CGA TGT TGT CCG AGC-3′，片段长度189 bp。β-catenin：正义链 5′-TGG TGA AAA TGC TTG GGT CG-3′，反义链5′-TCT GAA GGC AGT CTG TCG TAA TAG-3′片段长度189 bp。内参GAPDH：正义链5′-TTC CTA CCC CCA ATG TAT CCG-3′，反义链5′-CATGAGGTCCACCACCCTGTT-3′，片段长度281bp。

提取大鼠肾组织总RNA、应用微量核酸分光光度计检测总RNA的浓度和纯度；以20 μL为体系进行cDNA第一链的合成，采用荧光定量PCR仪，以25 μL为反应体系进行PCR扩增，取0.2 mL PCR管，配制如下反应体系（每个反转录产物配制3管）：2×qPCR Mix12.5 μL、7.5 μM基因引物2.0 μL、反转录产物2.5 μL、dH2O8.0μL。PCR扩增：预变性95℃，10min；循环（40次）95℃，15 s→60℃，60 s；溶解曲线75℃→95℃，每20 s升温1℃。反应完成后，采用2－△△CT计算法进行数据统计分析。

表1 各组对肾脏病理的影响（HE和Masson评分）

2.4 统计学分析

采用spss17.0统计软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差表示(sd)，组间均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P值小于或等于0.05将被认为差异有统计学意义。

3 结果

保元排毒丸高剂量组在造模过程中因麻醉而死亡一只。

3.1 肾组织HE染色和Masson染色

HE染色：UUO组见大部分肾小管管腔扩张明显，部分可见有蛋白或细胞管型，肾间质弥漫性炎性细胞浸润，部分肾小管萎缩或塌陷，部分肾小管上皮细胞脱落、溶解。保元排毒丸低、中、高剂量组和厄贝沙坦组肾小管轻度扩张，肾小管上皮细胞结构较完整，间质炎细胞浸润比UUO组减少（P＜0.01）。厄贝沙坦组与保元排毒丸各剂量组的病理变化大致相当（见图1、表1）。

Masson染色见假手术组肾小管间质、肾小球基底膜、系膜区无明显胶原沉积，UUO组见增宽的间质有较多蓝紫色条索状胶原，保元排毒丸各剂量组和厄贝沙坦组蓝紫色胶原沉积明显少于UUO组（P＜0.01）（计结果见图2、表1）。

图2 各组大鼠肾组织Msson染色（×200）

3.2 肾组织E-cadherin、Collagen I、β-Catenin表达水平

如图3、表2所示，与假手术组比较，UUO组E-cadherin表达均明显减少（P＜0.01），与UUO组比较，保元排毒丸低、中、高剂量组和厄贝沙坦组E-cadherin的表达增强（P＜0.01）；与假手术组比较，UUO组Collagen I、β-Catenin表达显著升高（P＜0.01）；保元排毒丸低、中、高剂量组和厄贝沙坦组Collagen I、β-Catenin表达明显少于UUO组（P＜0.01）。

图3 各组肾组织E-cadherin、Collagen I、β-Catenin蛋白的表达

表2 各组E-cadherin、Collagen I、β-Catenin蛋白结果比较

3.3 Real-time PCR检测Wnt4、β-catenin mRNA表达

如表3所示，与假手术组比较，UUO组和各给药组Wnt4、β-catenin表达均明显升高（P＜0.01）；与UUO组比较，各给药组Wnt4、β-catenin mRNA表达明显低于UUO 组（P＜0.05，P＜0.01），保元排毒丸低剂量组Wnt4的表达低于厄贝沙坦（P＜0.05）。

表3 各组对大鼠Wnt4、β-catenin mRNA的表达

4 讨论

肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）主要表现为成纤维细胞的增多及胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等细胞外基质的沉积[8]。RIF的发生发展受转化生长因子、结缔组织生长因子等细胞因子和TGF-β/smad、Wnt/β-catenin等信号通路的调控，其中，Wnt/βcatenin信号通路在促进RIF的发生发展中发挥重要的作用。

正常情况机体肾脏Wnt信号是沉默的[9]。当βcatenin在细胞核内蓄积时，能激活Wnt信号通路，启动靶基因转录，导致细胞增生、侵袭和转移。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路关键的信号转导分子，是该信号通路激活的标志[10]。Surendran等[11]发现UUO模型中Wnt4在集合管中有表达，肾小管上皮细胞胞浆中βcatenin表达增高。He等[12]证实UUO模型小鼠肾脏Wnt/β-catenin信号活性明显增强，Wnt/β-catenin信号通路的激活可促进肾纤维化。Villa等[13]表示，在UUO模型中，抑制β-catenin信号通路可减少肾脏纤维化。He等[14]发现抑制Wnt/β-catenin信号通路可以减少阿霉素肾病小鼠蛋白尿，抑制肾损伤和肾纤维化，均证实了Wnt信号通路在肾间质纤维化中发挥了重要作用。故本实验通过UUO模型大鼠观察保元排毒丸对Wnt4、β-catenin表达的影响。肾间质纤维化的主要成分是Ⅰ型胶原（collagensⅠ，ColⅠ）和Ⅲ型胶原（collagensⅢ，ColⅢ），其mRNA能合理地评估胶原的合成[15]，本实验选用Ⅰ型胶原的蛋白表达反映肾间质纤维化的程度。

保元排毒丸是全国名老中医张志坚教授治疗CKD及肾纤维化的经验方。张老将肾纤维化的病机归纳为“虚”、“湿”、“瘀”三个方面，肾元亏虚是肾纤维化始动原因，湿热、湿浊贯穿整过病程中、久病致瘀，浊聚成毒，病机关键是“肾元亏虚、湿浊毒瘀”，故治疗以补益肾元、祛湿化瘀、泄浊排毒为法。保元排毒丸据此病机治法研制而成，由生黄芪、黄精、生晒参、冬虫夏草、接骨木、生大黄、六月雪、丹参、陈皮、六神曲、木灵芝组成，为常州市中医医院使用了三十余年的治疗CKD的专科制剂，临床疗效可靠[3-5]。方中生黄芪甘温益气健脾、补肺固表、利水消肿；黄精甘平，归肺、脾、肾三经，补肾润肺健脾；生晒参，大补元气、补脾生津；冬虫夏草甘温益气，益肾补肺，金水同补；四药共奏补益肾元之功，治病之本。接骨木甘苦平，祛风利湿、活血化瘀；六月雪性平偏凉，活血化瘀、通经利水、清热解毒、利湿泄浊；生大黄苦寒泻下、荡涤肠胃、解毒化瘀、降泄浊邪；丹参，苦寒活血祛瘀；四药共奏祛湿化瘀、泄浊排毒之功，治病之标。陈皮，补气健脾、和胃止呕；六神曲，消食和胃；木灵芝益气养心安神。诸药相伍，补益肾元、祛湿化瘀、泄浊排毒。纵观全方补泄共施、升降相伍、清消并用，使清得以升，浊得以降，湿得以祛，毒得以解，从而气机通顺，三焦畅达。

本实验HE染色UUO组见大部分肾小管管腔扩张明显、部分可见有蛋白或细胞管型、肾间质弥漫性炎性细胞浸润、肾小管萎缩或塌陷、部分肾小管上皮细胞脱落、溶解；Masson染色见UUO组见增宽的间质有较多蓝紫色条索状胶原。UUO组E-cadherin表达明显少于假手术组和保元排毒丸各剂量组（P＜0.01），提示UUO组肾小管上皮的受损严重。UUO组ColⅠ的表达明显高于假手术组及保元排毒丸各剂量组，提示UUO组纤维化程度重，这说明造模成功。保元排毒丸各剂量组肾小管扩张程度轻、肾间质病变程度轻、肾间质纤维化程度轻，保元排毒丸各剂量组ColⅠ的表达明显低于UUO组（P＜0.01），提示保元排毒丸有延缓肾纤维化的作用。

本实验用Western Blot法和Real-time PCR法均证实UUO组β-catenin表达均明显高于假手术组（P＜0.01），UUO组Wnt4表达亦明显高于假手术组（P＜0.01）；说明在UUO模型大鼠中，Wnt4和β-catenin的表达增强，Wnt/β-catenin信号通路被激活，这与文献报道符合[16]；经过保元排毒丸治疗Wnt4和β-catenin表达均低于UUO组（P＜0.01），提示保元排毒丸能够下调Wnt4和β-catenin的表达，保元排毒丸可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路起到延缓肾纤维化的作用。

厄贝沙坦能减少肾小球细胞外基质蓄积，延缓肾小球硬化和肾间质纤维化的进展[17]，可部分通过下调β-catenin/Snail的表达抑制UUO大鼠RIF[18]。本实验保元排毒丸各剂量组抑制肾纤维化与厄贝沙坦效果相似。本实验将保元排毒丸设计了低、中、高三个剂量组，低剂量相当于平均临床等效剂量，低、中、高剂量组未见明显剂量依赖性量效关系，有可能低剂量是最有效剂量。

综上所述，在UUO模型大鼠中Wnt4和β-catenin的表达增强，Wnt/β-catenin信号通路被激活，保元排毒丸可下调Wnt4和β-catenin的表达；保元排毒丸有延缓肾纤维化的作用，其机理可能是通过抑制Wnt/βcatenin信号通路起到延缓肾纤维化的作用。

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