基于DNA条形码对湖北中药材市场的调查分析＊

汪 波，周豫新，覃 桂，胡志刚，胡军林＊＊

（1.湖北省药品监督检验研究院 武汉 430064；2.湖北中医药大学药学院 武汉 430065）

数千年来，中药以其特有疗效与作用，在防治疾病、保健康复方面显示出独特优势和魅力，是当前国际医药市场重要组成部分[1]。伴随自然医疗意识深入人心，中药以其疗效好、毒副作用小等特点，受到全世界消费者的关注[2]，据估算，65%-80%人口自主把健康治疗基础方式选择在中医药上，中药行业优势不断突显[3]，是国民经济重要支柱之一。

中药材的质量是中药质量的根本，也是保证中医临床用药安全有效的关键。近年来，受资源紧缺、市场需求膨胀、从业人员质量意识薄弱、监管不到位等多种因素影响[4]，中药材质量堪忧，以假充真，误用混用等现象屡禁不止，如以木防己、汉防己冒充防己，滇枣仁冒充酸枣仁，伊贝母充当川贝母，据对全国四万余批中药材及饮片调查发现其合格率仅63.93%，逾50种中药材掺伪率在50%以上，其中海风藤掺伪率达95%，大青叶掺伪率达94%，川贝母掺伪率达68%，半夏掺伪率62%[5]，中药材掺伪严重影响中药质量安全，调查发现近50%青蒿琥酯片为假药[6]，60%的红景天存在掺伪[7]，中药材掺伪已然成为危害公众健康的毒瘤，阻碍中药材产业和中医药事业健康发展[8]。

作为神农故里，时珍故乡，湖北省中医药历史悠久，资源丰富，道地药材品目繁多，是我国重要的药材主产区之一[9]，严格把控湖北省中药材质量对大健康产业发展具有不可忽视的促进作用。然而，当前药典规定的中药材性状特征多依野生资源制定，大量流通的栽培品与野生品间的性状差异给中药材真伪鉴定造成很大障碍，且近源种的化学成分相似，以其为标记物的鉴别手段力所不及[10]，给中药材质量监管提出一定挑战。

DNA条形码是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段实现物种鉴定的分子诊断新技术[11]，通过比较物种中的标准鉴定片段，对物种进行快速准确识别和鉴定。陈士林等通过分析753属4 800种6 600余份药用植物样本，提出以ITS2为主，叶绿体psbA-trnH为辅的植物类中药材鉴定体系[12]，并建立了信息量最为丰富的药材DNA条形码鉴定数据库，涵盖23,262种药用植物的78,847条序列（http://www.tcmbarcode.cn/china/）[13]，该鉴定体系已被中国药典2015年版收录。本研究旨在利用DNA条形码鉴定技术对湖北省市场流通中药材进行调查分析，探讨湖北省中药材掺伪情况，为中药材质量监管提供数据基础及技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用材料均为湖北市场流通中药材抽样，根及根茎类药材365份，皮类及茎木类药材35份，叶类及全草类药材3份，果实及种子类药材79份，动物类药材12份，其它类药材（如海金沙、蒲黄等）12份，共计中药材样品506份，隶属59个物种，涵盖动物、植物及真菌，涉及中药材相关企业及医疗机构89家。中药材DNA条形码识别系统由中国中医科学院中药研究所陈士林教授提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

对所收集的植物药材用75%乙醇擦拭表面后，刮掉外表面，取干燥组织约30 mg，用高通量组织研磨仪（Scientz-48，China）研磨120 s（50 Hz）至呈粉末状，使用植物DNA提取试剂盒（TIANGEN Biotech(Beijing)Co.,Ltd DP305-02）提取总DNA，稍作改进如：56℃水浴过夜，使用氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提2次，加入-20℃预冷的异丙醇沉淀DNA。动物药材用75%乙醇清洁表面后，取组织约30 mg，剪碎后使用核分离缓冲液（200 mM Tris-HCl，50 mM EDTA，250 mM NaCl，2%PVP-40，pH 8.0）洗涤样品两次，按照动物基因组DNA快速抽提试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，SK8222）标准操作流程提取总DNA。

1.2.2 PCR扩增

PCR扩增引物、反应体系及扩增程序等参考中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则（《中华人民共和国药典》2015年版通则9107），PCR扩增产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，对条带单一且清晰的PCR产物纯化后使用ABI3730XL（Applied Biosystems Co.,USA）测序仪进行双向测序。

1.2.3 数据处理

将测序所得峰图使用CodonCode Aligner V3.7.1（CodonCode Co.,USA）校对拼接，去除引物区及低质量区，从而获得植物类中药材ITS2鉴定序列及动物类中药材COI鉴定序列，采用MEGA6.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）对所获序列进行比对分析。据中药材DNA条形码识别系统操作流程，与标准数据库进行比对，比对算法采用Blast1，E值（E-value）设为1e-5[14]，确定样品拉丁名后，与2015年版中国药典规定的基原物种比对判别药材真伪。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增成功率

从收集的506份样品中，成功获得动物类药材鉴定序列COI 12条，植物类药材鉴定序列ITS2 482条，共计494份样品获得高质量鉴定序列，总体来看，PCR扩增成功率占总抽样的98%。果实及种子类药材、皮类及茎木类药材、叶类及全草类药材和动物类药材的扩增成功率均为100%；根及根茎类扩增成功率次之为98%，红参、天麻等品种未得到有效扩增；其它类药材扩增成功率75%，如乳香、没药等品种未能检测到扩增条带（图1）。

图1 抽取样品DNA条形码鉴定统计分析结果

2.2 鉴定成功率

在获得的494条序列中，经比对可确定物种的序列477条，鉴定成功率为97%。如图1所示果实及种子类药材、叶类及全草类药材和动物类药材均能准确鉴定到种，约1%（4/365）的根及根茎类药材（粉葛）、37%（13/35）的皮类及茎木类药材（黄柏）仅能鉴定到属。

2.3 中药材掺伪情况分析

经过与DNA条形码标准数据库比对，共鉴定出伪品28份，占所抽查样品的5.5%。根及根茎类药材伪品比例为6%，其中川贝母掺伪率20%，法半夏17%，黄芩5%；果实及种子类药材掺伪率6.3%，青葙子及桃仁分别存在50%和44%的掺伪；皂角刺掺伪率9%，占皮类及茎木类药材的2.9%（图2）；叶类及全草类和动物类药材经鉴定均为正品。

图2 中药材伪品鉴定结果统计图

据《中华人民共和国药典》2015年版规定川贝母基原川贝母（Fritillaria cirrhosa）、暗紫贝母（F.unibracteata）、甘肃贝母（F.przewalskii）、梭砂贝母（F.delavayi）、太白贝母（F.taipaiensis）或瓦布贝母（F.wabuensis），法半夏基原半夏（Pinellia ternata），黄芩基原黄芩（Scutellaria baicalensis），青葙子基原青葙（Celosia argentea），桃仁基原桃（Prunus persica）或山桃（P.davidiana），皂角刺基原皂荚（Gleditsiasinensis）。

3 讨论

3.1 DNA条形码鉴定技术在中药材质量控制中的优势

DNA条形码鉴定法较传统鉴定方法，技术简便，易于操作；鉴定准确，具有独一无二的可重复性；使用方便，采用标准操作流程可批量完成鉴定工作[15]。本研究按照《中华人民共和国药典》2015年版提供的标准操作流程，在两周时间内完成了506份中药材鉴定工作，成功获得494份样品的DNA条形码序列，准确鉴定477份样品，鉴定成功率达97%。针对多基原药材及种子类药材的鉴定更是展现出独特优势，如川贝母基原为六种同属植物，各基原物种间及栽培品与野生品间的性状差异较小，使得形态鉴定困难，掺伪严重，本研究中有20%的川贝母样品经DNA条形码鉴定为伊贝母；种子类药材形状小，性状特征相似，真伪更是难辨，经DNA序列比对，发现44%的桃仁样品为苦杏仁，青葙子实为绿穗苋种子（图2）。DNA条形码鉴定技术在对中药材质量控制方面具有显著的优越性。

3.2 PCR扩增失败原因分析

3.2.1 中药炮制品

中药材在加工处理过程中，常会采用繁琐炮制手段[16]，如红参炮制工艺蒸制3h，70℃烘10 h；天麻105℃蒸制20min，切薄片，(70±2)℃干燥4 h。经长时间高温处理会导致DNA严重降解影响PCR扩增效率，在本研究中收集了红参样品1份，天麻7份，均扩增失败，此类样品的鉴定方法仍有待优化，如采用磁珠法[17]等提高DNA提取效率，或采用小片段DNA条形码序列[18]等提高PCR扩增效率。

3.2.2 树脂类药材

树脂类药材源自植物分泌物或渗出物，如源自松科的松香，棕榈科的血竭，橄榄科的乳香和没药都是常见的树脂类药材，这类药材DNA含量极低，降解也是极为严重，本研究收集的树脂类药材也均扩增失败，树脂类药材分子鉴定仍是DNA条形码鉴定难点。作者曾以长度100 bp的trnL内含子P6环序列为DNA条形码成功鉴定了树脂类药材血竭及其混伪品龙血竭[19]，小片段DNA序列在树脂类药材鉴定中极具潜力，但由于片段过小，变异位点有限，仍需扩大样本评估鉴定效率。

3.3 物种鉴定失败原因分析

尽管以ITS2为主psbA-trnH为辅的DNA条形码体系对绝大部分中药材具有很好的鉴定效率，但由于其片段长度限制，对部分近源种的鉴定仍有局限性，如黄柏与关黄柏，分别为黄皮树（Phellodendronchinense）和黄檗（P.amurense）的干燥树皮，与本研究结果一样，现有条形码序列并不能对其进行区分[20]。葛根和粉葛分别来源于野葛（Pueraria lobata）和甘葛藤（P.thomsonii），现版药典将其分列为两个品种，但据中国植物志记载甘葛藤为野葛变种，属种下关系，而中药材DNA条形码鉴定体系仅针对种水平的鉴定，葛根和粉葛的DNA序列相似度极高。对于现有DNA条形码鉴定能力较差的物种，将考虑重新筛选适宜鉴定序列[21]或采用单核苷酸多态性（SNP）检测[22]。

4 展望

DNA作为遗传信息载体，具极高遗传稳定性，不受发育阶段、外部环境、组织差异影响，鉴定结果具高度重复性和稳定性，可用于中药材标准化真伪鉴定[23]，是中药材监管有效手段。不断完善近源种及特殊炮制药材DNA条形码鉴定方法，针对掺伪严重品种建立快速检测体系，与其它中药检测技术手段不断融合，必将对中药产业现代化、标准化起到巨大推动作用。

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