周龄对C57BL/6小鼠胶原诱导关节炎造模成功率的影响＊

郑 康，郭晴晴，刘 学，邱雪梅，樊丹平，赵雨坤，吕爱平，何小鹃＊＊

（1.中国中医科学院中医临床基础医学研究所 北京 100700；2.香港浸会大学中医药学院 香港；3.西南交通大学生命科学与工程学院 成都 6100312）

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种以慢性系统性关节滑膜炎症为特征的多关节自身免疫系统疾病，其基本病理改变为关节滑膜炎症导致的关节滑膜异常增生、血管翳形成，软骨和软骨下骨质破坏，关节发生畸形和强直。胶原诱导关节炎（Collageninduced arthritis，CIA）小鼠在临床表现以及病理改变等方面与类风湿关节炎有诸多相似之处，是目前用于研究RA最常用也是最理想的一种实验动物模型[1,2]。DBA/1小鼠作为CIA模型的“金标准”造模技术路线已十分成熟[3,4]。但随着分子生物学及细胞工程新技术的发展，遗传工程技术改造的基因工程小鼠已广泛应用于生物学及现代医学领域的研究。基因打靶技术下的转基因小鼠多数使用C57BL/6小鼠而非DBA/1小鼠，但C57BL/6小鼠CIA造模发病率存在很大的不确定性[5]，因此对影响C57BL/6小鼠CIA造模发病率条件的筛选及方法优化尤为重要。

1 试剂与动物

1.1 动物

C57BL/6小鼠50只，雌雄各半，SPF级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号码：SCXK（京）2014－0004。在恒温恒湿环境中适应性饲养1周后进行实验。

1.2 试剂

完全弗氏佐剂（Chondrex）、鸡II型胶原（Chondrex）、苏木素染色液（北京雷根生物技术有限公司）、伊红染色液（北京雷根生物技术有限公司）、TNF-a、IL-1β、IL-6酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒(eBioscience)。

2 方法

2.1 小鼠胶原诱导关节炎模型的制备

低温冰水浴条件下，将鸡Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂以1∶1等体积比例混合，搅拌乳化机乳化至滴水不溶状态。充分乳化后2 h内将乳剂与尾根部皮下注射，每只小鼠100 μL。与21天后加强免疫一次，相同方法注射每只小鼠50 μL[6]。

2.2 小鼠关节炎评分

小鼠造模发病后开始关节炎评分，每周两次。评分标准如下：0分=无红肿；1分=小趾关节红肿；2分=趾关节和小趾关节肿胀；3分=踝关节以下部位肿胀；4分=整个足爪肿胀（包含踝关节）。每次记录小鼠四肢的评分，累计最高评分为16分。

2.3 病理学观察

第一次免疫49天后，将小鼠处死，分离小鼠发病关节后于4%多聚甲醛中固定48 h。固定后置于10%EDTA脱钙液中脱钙，每日更换脱钙液直至脱钙完全。将脱钙好的踝关节分别与浓度梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片后经苏木素-伊红（H＆E）染色，中性树胶封固后显微镜下观察。

2.4 血清炎症因子检测

第一次免疫49天后，将小鼠处死并分离小鼠血清。参照订购ELISA试剂盒说明书操作检测小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子的表达。

2.5 统计学处理

统计学处理数据采用SPSS13.0软件处理，两组间差异采用t检验；多组间差异采用S-N-K的方差分析，分析前各组及组间进行正态分布和方差齐性检验。

3 结果

3.1 胶原诱导关节炎小鼠造模成功率与周龄的关系

由表1结果可见，相同胶原诱导关节炎方法下，7周龄组小鼠造模成功率为20%；10周龄组造模成功率30%；11周龄组小鼠造模成功率30%；12周龄组小鼠造模成功率40%；14周龄组小鼠造模成功率为60%。使用GraphPad Prism 6将小鼠周龄与造模成功率做相关性分析，由图一结果可见，小鼠造模成功率随周龄增加，相关性分析结果为R2=0.8645。

表1 各周龄胶原诱导关节炎小鼠造模成功率

图1 胶原诱导关节炎小鼠造模成功率与周龄关系

3.2 造模成功率与小鼠性别关系

造模成功率与小鼠性别关系由结果可见，雄性小鼠造模成功率为54%，雌性小鼠造模成功率46%，二者之间无统计学差异（n=25，P＞0.05）。

3.3 胶原诱导关节炎小鼠关节炎评分及病理变化

图3结果显示胶原诱导关节炎小鼠于第一次免疫28天后开始出现关节炎临床症状，随时间推移，于第一次免疫40天后达到峰值。图4结果A显示胶原诱导关节炎小鼠发病后踝关节出现明显肿胀，趾关节红肿并发生明显形态变化，正常小鼠（B）关节正常无变化，符合CIA造模后49天典型的关节炎症状。图5关节病理结果显示，CIA造模49天后小鼠关节局部出现典型的关节炎病理症状，包括关节局部炎性细胞浸润，骨破坏及血管翳形成，如箭头所示。图6结果显示，CIA造模后小鼠血清炎症因子IL-1β，IL-6和TNF-α与正常组小鼠相比明显升高（n=8；**，与正常小鼠Non-CIA相比，P＜0.01）。

图2 造模成功率与小鼠性别关系

图3 胶原诱导关节炎小鼠关节炎评分

图4 胶原诱导关节炎小鼠大体特征

图5 胶原诱导关节炎小鼠病理特征（放大倍数：300倍）

图6 胶原诱导关节炎小鼠血清炎症因子

4 讨论

类风湿关节炎作为免疫系统疾病，其发病受到年龄影响[7-9]。本研究结果显示，C57BL/6小鼠CIA造模成功率受小鼠周龄变化的影响。随着小鼠周龄的增加，CIA造模成功率逐渐提高。

研究表明，机体的免疫功能变化与机体免疫细胞凋亡有密切关系[15,10]。而T细胞的分布及功能作为细胞免疫功能的核心[11,12]，又与年龄的变化的联系密切[13]。有研究结果表明，T细胞是免疫系统各种成分中对老化过程最敏感的成分,随着年龄的增加，机体中T细胞功能首先发生变化[14,15]。随着小鼠周龄的增加，小鼠中枢免疫器官T细胞活化功能和细胞免疫功能受到影响[15,16]，对外源性抗原免疫应答逐渐增高[15,18,19]。因此，随着小鼠周龄的增加，小鼠机体T细胞的功能受到影响，引起免疫反应的敏感，从而可能导致CIA造模成功率的增加。本实验的研究结果与这一预测相符，但具体机制还需进一步的研究确认。

本研究中我们采用小鼠分别为7，10，11，12及14周龄，其中发病率最高小鼠为14周龄，且此周龄段小鼠[20]为成熟期小鼠，是CIA造模小鼠中常用周龄段小鼠。造模后小鼠临床评分所显示的肿胀程度、小鼠关节病理结果等均显示为典型类风湿关节炎小鼠症状。这一结果也为选用C57BL/6小鼠开展类风湿关节炎的相关研究提供了实验参考。

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