响应面法优化二次发酵红曲火龙果酒发酵工艺

陈 烁,周鸿翔*,王晓丹,唐开永,刘彩婷

(1.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院,贵州 贵阳 550025)

火龙果为量天尺属植物,其果实风味良好,含多种营养元素,具有抗氧化、抗癌、预防贫血、防止心血管疾病等功效［1-3］。相对于大多数水果,红心火龙果含较高的膳食纤维、有较好的抗氧化能力和自由基清除力［4］。甜菜苷类色素是火龙果中重要的功能物质,主要分布在果皮中,具有抗氧化、预防动脉硬化等功效［5-6］。以火龙果为原料发酵制得果酒,色泽鲜艳、口感良好,具有较好的保健功能［7-8］。

红曲是以大米为原料,经红曲霉发酵制成的米曲,具有降血脂、降胆固醇、抗癌等功能,其主要功能性物质为红曲色素和Monacolin K［9-10］。红曲常作为发酵剂被用于酿制红曲米酒［11-12］或作为保健品被食用。红曲具有较好的酯化能力,可与酵母菌协同发酵,对酒质产生影响。蒋育萌等［13］在浓香型酒发酵糟中加入酯化红曲,使基酒中己酸乙酯含量提高0.35～0.58 g/L。罗威等［14］利用红曲和酵母发酵,制得红曲荔枝果酒具有较好的品质。张庆庆等［15］利用红曲和酵母发酵,制得红曲菠萝酒与其他果酒的风味成分结构有所不同。

前期试验结果显示同时添加酵母和红曲发酵的红曲火龙果酒发酵周期长、酒精度低、总酯含量低、色泽较差。本试验采用先由酵母进行一次发酵,后以红曲进行二次发酵的工艺酿造红曲火龙果酒,以期起到提高发酵酒总酯含量,改善色泽的作用。通过感官评价红曲火龙果酒品质、对发酵工艺进行优化,得出最优的新型红曲火龙果酒产品工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红心火龙果：贵州省罗甸县；RW果酒酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；红曲米：福建省古田县帝源红曲厂。

1.2 仪器与设备

MJX-70BⅢ霉菌培养箱、DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；HPX-9162MBE数显电热培养箱：上海博迅实业有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程及操作要点

榨汁：将红心火龙果去皮、压榨、过滤后制得火龙果汁待用；

调配：在火龙果汁中加入一定量蔗糖,搅拌均匀后待用；

一次发酵：取一定量安琪RW果酒酵母于30 g/L蔗糖溶液中,混合均匀后于35℃恒温水浴锅活化30 min；将活化后的酵母种子液加入果汁中,搅拌均匀后于培养箱中恒温发酵；

二次发酵：取一定量红曲米,以适量水润湿后于35℃恒温水浴锅中活化1 h；将活化后的红曲米加入杀菌后的一次发酵液中,搅拌均匀后于霉菌培养箱中恒温发酵；

过滤、杀菌：一次发酵或二次发酵结束后,取出发酵液进行真空抽滤,将滤液于65℃恒温水浴锅中水浴30 min,取出后自然冷却。

1.3.2 一次发酵条件优化

(1)单因素试验

以酒精度、还原糖含量和感官评分为评价指标,分别考察发酵时间(0、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d)、发酵温度(24℃、26℃、28℃、30℃、32℃)、酵母接种量(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%)、加糖量(10%、13%、16%、19%、21%)对红曲火龙果酒一次发酵的影响。

(2)响应面法优化

在单因素试验基础上,以感官评分(Y1)为响应值,采用响应面法进行红曲火龙果酒一次发酵工艺条件的优化,响应面试验因素与水平如表1所示。

表1 红曲火龙果酒一次发酵工艺条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for primary fermentation conditions optimization of Monascus pitaya wine

1.3.3 二次发酵条件优化

(1)单因素试验

在一次发酵优化条件基础上,以总酯含量和感官评分为评价指标,分别考察发酵时间(0、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h)、红曲米添加量(5%、10%、15%、20%、25%)、发酵温度(28℃、31℃、34℃、37℃、40℃)对红曲火龙果酒二次发酵的影响。

(2)响应面优化

在单因素试验基础上,以总酯含量(Y2)和感官评分(Y3)为响应值,采用响应面法进行红曲火龙果酒二次发酵工艺条件优化,试验因素与水平如表2所示。

表2 红曲火龙果酒二次发酵条件优化响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for secondary fermentation conditions optimization of Monascus pitaya wine

1.3.4 测定方法

(1)理化指标

酒精度：采用蒸馏法测定［16］；总酯含量：采用点位滴定法测定［17］；还原糖含量：采用3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法测定［18］。

(2)感官评价

参照文献［19］的感官要求,对红曲火龙果酒进行感官评价,评价标准如表3所示。

表3 红曲火龙果酒感官评价标准Table 3 Sensory evaluation standards of Monascus pitaya wine

2 结果及分析

2.1 一次发酵单因素试验

2.1.1 发酵时间的确定

在加糖量16%、酵母接种量0.03%、发酵温度28℃的条件下,考察发酵时间对样品还原糖、酒精度、感官评分的影响,结果分别如图1、图2所示。由图1、图2可知,在发酵液中加糖后,糖逐渐溶解,酵母菌将二糖转化为单糖,并进行酒精发酵。发酵液中还原糖先迅速上升,后持续下降,第5天后保持稳定；由酒精度和还原糖变化趋势显示,发酵液于第5天后发酵接近终点。发酵时间少于5 d的样品酒精度低,残糖高,感官评分较低。长时间发酵的样品虽具有较高酒精度,但果香味减弱、协调性变差,导致评分不高。第5天时样品评分最高,第8天次之。发酵时间延长不能使感官品质提高,且会增加产品生产周期,因此选择较优的发酵时间为5 d。

图1 发酵时间对一次发酵样品还原糖、酒精度的影响Fig.1 Effect of fermentation time on reducing sugar and alcohol content of primary fermentation sample

图2 发酵时间对一次发酵样品感官评分的影响Fig.2 Effect of fermentation time on sensory score of primary fermentation sample

2.1.2 发酵温度的确定

在加糖量16%、酵母接种量0.03%、发酵时间5 d的条件下,考察发酵温度对样品还原糖、酒精度、感官评分的影响,结果分别如图3、图4所示。

图3 发酵温度对一次发酵样品还原糖、酒精度的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on reducing sugar and alcohol content of primary fermentation sample

图4 发酵温度对一次发酵样品感官评分的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on sensory score of primary fermentation sample

由图3、图4可知,过低的温度不利于发酵,其中当发酵温度为24℃时的样品残留大量还原糖,酒精度低,感官评分低。较高温度条件下还原糖含量趋近为零,当发酵温度为28℃和30℃时样品酒精度＞13%vol,感官评分＞80分,表明发酵取得较好效果。发酵温度过高时样品色泽较鲜艳,但口感偏酸,感官评分下降。因此选择较优的发酵温度为28℃。

2.1.3 酵母接种量的确定

在加糖量16%、发酵时间5 d、发酵温度28℃的条件下,考察接种量对样品还原糖、酒精度、感官评分的影响,结果分别如图5、图6所示。

图5 接种量对一次发酵样品还原糖、酒精度的影响Fig.5 Effect of inoculum on reducing sugar and alcohol contents of primary fermentation sample

图6 接种量对一次发酵样品感官评分的影响Fig.6 Effect of inoculum on sensory score of primary fermentation sample

由图5、图6可知,随接种量的增加,样品酒精度增加。当接种量为0.01%时发酵液酒精度低且果酒风味最差；当接种量为0.05%时,可能由于样品前期发酵速度快导致果酒偏酸,感官评分也较低。因此选择较优的接种量为0.03%。

2.1.4 加糖量的确定

在发酵时间5 d、酵母接种量0.03%、发酵温度28℃的条件下,考察加糖量对样品还原糖、酒精度、感官评分的影响,结果分别如图7、图8所示。

表4 一次发酵条件优化响应面试验设计与结果Table 4 Design and results of response surface experiments for primary fermentation conditions optimization

图7 加糖量对一次发酵样品还原糖、酒精度的影响Fig.7 Effect of sucrose addition on reducing sugar and alcohol contents of primary fermentation sample

图8 加糖量对一次发酵样品感官评分的影响Fig.8 Effect of sucrose addition on sensory score of primary fermentation sample

由图7、图8可知,样品酒精度随加糖量的增加而增加,但加糖量＞16%后,糖分在发酵周期内未能被完全利用而残留在发酵液中,酒精度不再继续上升。样品的感官评分呈先上升后下降的趋势,加糖量过低的样品酒精度低,发酵风味不突出,加糖量过高则残糖过多,口味过甜。因此选择较优的加糖量为16%。

2.2 一次发酵条件响应面优化

采用Design-Expert 8.05软件对试验结果进行多元回归拟合,得到以感官评分(Y1)为评价指标的函数二次回归方程为：

Y1=85.52+2.47A+2.15B+0.12C+2.63D-0.65AB+0.47AC-1.00AD-1.70BC-0.20BD-0.50CD-2.47A2-2.16B2-0.94C2-2.83D2

由回归方程可知,加糖量(D)对一次发酵样品感官评分的影响最大,发酵时间(A)和发酵温度(B)次之,接种量(C)的影响最小；发酵温度和接种量交互作用对样品感官评分影响最大,发酵温度和加糖量交互作用的影响最小。对响应面试验结果进行方差分析,结果如表5所示。

由表5可知,通过方差分析,得到模型相关系数R2=0.972 1；调整相关系数R2Adj=0.944 2。模型一次项A、B、D,交互项BC,二次项A2、B2、D2极显著(P＜0.01)；交互项AD,二次项C2显著(P＜0.05)；一次项C,交互项AB、AC、BD、CD项不显著(P＞0.05),交互项AD、BC的交互作用对一次发酵样品感官评分的影响见图9。

由图9可知,一次发酵最优条件为发酵时间5.27d,发酵温度29.34℃,接种量0.0241%,加糖量17.35%；此条件下模型预测感官评分为87.120 5分。为方便实际操作,将优化条件调整为发酵时间5.3 d,发酵温度29.3℃,接种量0.024%,加糖量17.4%。在此发酵条件下进行发酵,样品感官评分为(86.8±0.3)分,与预测结果较接近,表明响应面优化红曲火龙果酒一次发酵结果可行。

表5 一次发酵响应面试验结果方差分析Table 5 Variance analysis of response surface experiments for primary fermentation

图9 发酵时间、发酵温度、接种量、加糖量交互作用对一次发酵样品感官评分影响的响应曲面和等高线Fig.9 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation time,temperature,inoculum and sugar addition on sensory score of primary fermentation sample

2.3 二次发酵单因素试验

2.3.1 发酵时间的确定

以一次发酵最优发酵条件制备红曲火龙果酒一次发酵酒,在发酵温度31℃、红曲米添加量10%条件下,考察发酵时间对二次发酵样品总酯含量、感官评分的影响,结果如图10所示。由图10可知,发酵初期总酯含量略有降低,发酵中期红曲霉生长代谢产生酯化酶,促进酯类物质生成,发酵后期总酯含量趋于稳定。发酵前期样品感官评分逐渐增高,但过长时间的发酵导致发酵液酸味迅速加重,红曲苦味突出,因此发酵超过72 h后的样品感官评分迅速降低。因此选择二次发酵时间为48 h、60 h、72 h进行后续试验。

图10 发酵时间对二次发酵样品总酯含量、感官评分的影响Fig.10 Effect of fermentation time on total ester contents and sensory score of secondary fermentation sample

2.3.2 红曲米添加量的确定

在发酵温度31℃、发酵时间60 h条件下,考察红曲米添加量对二次发酵样品总酯含量、感官评分的影响,结果如图11所示。由图11可知,样品总酯含量和感官评分变化趋势大致相同,先随红曲米添加量增加而上升,然后迅速下降。由于底物浓度和发酵时间的限制,红曲米过多添加时样品总酯含量不会增加,但强烈的红曲苦味降低了风味品质。因此选择红曲米添加量5%、10%、15%进行后续试验。

图11 红曲米添加量对二次发酵样品总酯含量、感官评分的影响Fig.11 Effect of red kojic rice addition on total ester contents and sensory score of secondary fermentation sample

2.3.3 发酵温度的确定

在发酵时间60 h、红曲米添加量10%条件下,考察发酵温度对二次发酵样品总酯含量、感官评分的影响,结果如图12所示。由图12可知,样品总酯含量和感官评分均先随发酵温度升高而增加,超过31℃后逐渐下降。过高温度发酵的样品色泽较好,但酸味失调、口感较差,导致感官评分较低。因此选择发酵温度28℃、31℃、34℃进行后续试验。

图12 发酵温度对样品总酯含量、感官评分的影响Fig.12 Effect of fermentation temperature on total ester contents and sensory score of secondary fermentation sample

2.4 二次发酵条件响应面优化

表6 二次发酵条件优化响应面试验设计与结果Table 6 Design and results of response surface experiments for secondary fermentation conditions optimization

采用Design-Expert 8.05软件对试验结果进行多元回归拟合,得到以总酯含量(Y2)为评价指标的函数二次回归方程为：

Y2=15.41-0.58A+0.017B-0.04C+0.05AB-0.028AC+0.042BC+0.73A2-6.7×10-3B2-0.058C2

以感官评分(Y3)为评价指标的二次回归方程为：

Y3=91.12-0.2A-0.35B+1.45C+0.35AB+1.05AC+0.15BC-0.39A2-0.69B2-3.68C2

由回归方程可知,红曲米添加量对二次发酵样品的总酯含量影响最大,发酵时间和发酵温度影响较小。红曲米添加量和发酵温度的交互作用对样品总酯含量影响最大,发酵温度和发酵时间的交互作用次之。发酵时间对样品的感官评分影响最大,红曲米添加量和发酵温度的影响较小。红曲米添加量和发酵时间的交互作用对样品的感官评分影响最大,其次为红曲米添加量和发酵温度的交互作用。对响应面试验结果进行方差分析,结果分别如表7、表8所示。

表7 总酯含量为评价指标的二次发酵响应面试验结果方差分析Table 7 Variance analysis of response surface experiments of secondary fermentation using total ester content as evaluation index

表8 感官评分为评价指标的二次发酵响应面试验结果方差分析Table 8 Variance analysis of response surface experiments of secondary fermentation using sensory value as evaluation index

由表7可知,以总酯含量为响应值的模型相关系数R2=0.998 5,调整相关系数R2Adj=0.996 6。模型一次项E,二次项E2、G2极显著(P＜0.01)；一次项G,交互项EF、FG显著(P＜0.05)；一次项F,交互项EG,二次项F2不显著(P＞0.05)。

由表8可知,以感官评分为响应值的模型相关系数R2=0.971 0,调整相关系数R2Adj=0.933 6。模型一次项G,二次项G2极显著(P＜0.01)；交互项EG显著(P＜0.05)；一次项E、F,交互项EF、FG,二次项E2、F2不显著(P＞0.05)。

图13 发酵时间、红曲米添加量、发酵温度交互作用对样品总酯含量影响的响应曲面与等高线Fig.13 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation time,red kojic rice addition and fermentation temperature on total ester contents

图14 发酵时间和红曲米添加量交互作用对样品感官评分影响的响应曲面与等高线Fig.14 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation time and red kojic rice addition on sensory score

通过响应面试验分析,红曲米添加量对总酯含量有极显著影响,增加红曲米添加量使得样品总酯含量上升,但会降低感官品质。以总酯含量为最高的优化条件和以感官评分为最高的优化条件相互冲突,出于果酒风味品质的角度考虑,发酵条件优化应以感官评分为评价指标。以感官评分为最高的优化二次发酵条件为红曲米添加量9.2%,发酵温度30.16℃,发酵时间62.04 h；模型预测样品总酯含量为(15.44±0.011)g/L,感官评分为91.31分。为方便实际操作,将发酵条件调整为红曲米添加量9.2%,发酵温度30.2℃,发酵时间62 h。在此发酵条件下进行红曲火龙果酒二次发酵,得到样品总酯含量为(15.42±0.012)g/L,感官评分为(91.1±0.3)分,与预测结果较接近,表明响应面优化红曲火龙果酒二次发酵结果可行。

3 结论

红曲火龙果酒是以火龙果为原料,采用两次发酵的方式制得的发酵酒。在一次发酵过程中,样品感官评分受到发酵时间、发酵温度、加糖量、酵母接种量的影响。通过一次发酵响应面分析结果可知,加糖量、发酵时间、发酵温度对感官品质影响较大,酵母接种量影响较小。一次发酵条件优化为发酵时间5.3d,发酵温度29.3℃,酵母接种量0.024%,加糖量17.4%。通过验证试验,在优化发酵条件下制得红曲火龙果酒一次发酵样品感官评分为86.8分。

在二次发酵过程中,样品总酯含量和感官评分受到发酵时间、发酵温度、红曲添加量的影响。通过二次发酵响应面分析结果可知,红曲米添加量对样品总酯含量影响最大,发酵时间对感官评分影响均最大,发酵温度对二者的影响较小。二次发酵条件优化为：红曲米添加量9.2%,发酵温度30.2℃,发酵时间62 h。通过验证试验,在一次和二次优化发酵条件下制得的红曲火龙果酒总酯含量为15.42 g/L,感官评分为91.1分。

经过两次发酵的红曲火龙果酒,其色泽呈现亮丽的宝石红色,香气优雅,带有火龙果的清新果香味和红曲米酒的风味,酒体协调、醇厚、丰满。通过响应面优化,得到了红曲火龙果酒的最佳发酵工艺,并为后续进一步研究提供了参考。

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