卡那霉素连续补料发酵工艺的研究

2018-05-09，，

发酵科技通讯 2018年1期

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(浙江金华康恩贝生物制药有限公司，浙江金华 321016)

卡那霉素(kanamycin)是1957年由日本人梅泽滨夫从卡那链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)发酵液中提取出的一种氨基糖苷类抗生素[1].卡那霉素在国内已有30多年的生产史.长期以来，普遍采用不补料、不控制pH的分批发酵工艺，高浓度碳、氮源发酵培养基经灭菌、接种后进行发酵，发酵过程中每天补水1 次，发酵液流变性差、供氧和传质效果弱.发酵前期由于大量糖的消耗，pH过低，不利于链霉菌生长.发酵中后期，发酵液过多的氮源分解以及菌体的早衰导致pH过高，不利于菌体的代谢和卡那霉素的合成，发酵水平长期徘徊在8 000 U/mL左右.赖滨霞采用间歇补料工艺，效价达8 800 U/mL以上[2].补料分批发酵技术已大量应用于发酵过程中[3-5].

针对目前国内卡那霉素生产现状及问题，采用发酵过程连续补料工艺，均匀营养、改善供氧和发酵液流变性，控制pH，提高生产菌的代谢和卡那霉素的合成.新发酵工艺较大幅度提高了发酵水平.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

卡那链霉菌(Streptomyceskanamyceticus)0708，由浙江金华康恩贝生物制药有限公司研发中心提供；枯草芽孢杆菌63501由浙江金华康恩贝生物制药有限公司质量控制部提供.

1.1.2 培养基

种子培养基：玉米淀粉30 g/L，黄豆饼粉20 g/L，葡萄糖6 g/L，玉米粉10 g/L，NaNO31 g/L，CaCO34 g/L，淀粉酶0.03 g/L.pH自然，121 ℃灭菌30 min.

原发酵培养基：玉米淀粉60 g/L，麦芽糖50 g/L，黄豆饼粉50 g/L，蛋白胨5 g/L，NaNO38 g/L，KH2PO40.2 g/L，CaCO32 g/L，ZnSO4·7H2O 0.2 g/L，淀粉酶0.05 g/L，豆油5 g/L，PPE聚醚消泡剂0.1 g/L；pH 6.8～7.2，121 ℃灭菌30 min.

新发酵培养基：玉米淀粉50 g/L，黄豆饼粉30 g/L，蛋白胨5 g/L，NaNO34 g/L，KH2PO40.2 g/L，CaCO32 g/L，ZnSO4·7H2O 0.2 g/L，淀粉酶0.05 g/L，豆油10 g/L，PPE聚醚消泡剂0.1 g/L；pH 6.8～7.2，121 ℃灭菌30 min.

补料培养基：淀粉水解液400 g/L，酵母粉90 g/L，分别进行121 ℃灭菌30 min.

1.2 方法

1.2.1 摇瓶培养条件

斜面培养条件：用接种环取卡那链霉菌0708在斜面上划线接种，28 ℃培养108 h.

种子培养条件：挖取斜面上活化的菌苔，接种到80 mL种子培养液中(750 mL园底三角瓶)，摇瓶机转速220 r/min，28 ℃培养48 h.

发酵培养条件：按10%接种量，将种子液接种到80 mL发酵培养液中(750 mL园底三角瓶)，27 ℃培养144 h，摇瓶机转速230 r/min.

1.2.2 发酵罐培养条件

50 L发酵罐装液量25 L，接种量10%，培养温度27 ℃，罐压0.05 MPa, 空气量15～35 L/min, 搅拌转速300～600 r/min，培养时间144 h.

补料方法：使用蠕动泵流加玉米淀粉水解液，控制发酵液总糖质量浓度(25±5) g/L；发酵72 h后，当溶氧回升时流加酵母粉溶液(2±0.1) g/(L·d)；用工业氨水控制发酵液pH为6.8±0.02.

1.2.3 分析方法

卡那霉素效价测定方法：管碟法

其他参数测定方法：

1) 糖测定方法：斐林试剂法.

2) 氨基氮测定方法：甲醛法.

3) 菌体浓度的测定：取发酵液10 mL，3 500 r/min离心10 min，计算沉降物占发酵液的百分比.

2 结果与分析

2.1 降低发酵培养基初始糖质量浓度对卡那霉素合成的影响

原发酵培养基配方中含有玉米淀粉60 g/L、麦芽糖5 g/L，初始糖质量浓度高，导致发酵液流变性差.为降低发酵液黏度、提高溶氧、节约成本，研究降低发酵培养基初始糖质量浓度对卡那霉素合成的影响，结果见表1.

表1降低发酵培养基初始糖质量浓度对卡那霉素合成的影响

Table1Effectofreducingfermentationculturedinitialsugarconcentrationonkanamycinsynthesis

序号玉米淀粉/(g·L-1)麦芽糖/(g·L-1)豆油/(g·L-1)卡那霉素效价/(U·mL-1)对照60505566915050106330250401063623503010652545020106422550101062256500106134

由表1可见：1) 玉米淀粉从60 g/L降到50 g/L，豆油从5 g/L升到10 g/L，效价提高11.66%；2) 玉米淀粉从60 g/L 降到50 g/L，豆油从5 g/L升到10 g/L，麦芽糖从50 g/L降到30 g/L，效价比对照提高15%，说明适当地降糖加油有利于卡那霉素合成；3) 维持玉米淀粉50 g/L、豆油10 g/L，只是麦芽糖质量浓度从50 g/L 降到30 g/L，效价提高3%，麦芽糖质量浓度继续从30 g/L降到0 g/L，效价下降6%.说明麦芽糖对卡那霉素合成的影响不显著，出于经济成本考虑，发酵培养基初始配方中选择玉米淀粉50 g/L、豆油10 g/L、麦芽糖0 g/L作为新配方的碳源组合.

2.2 降低发酵培养基含氮量对卡那霉素合成的影响

原发酵培养基中含有黄豆饼粉50 g/L，NaNO38 g/L，降低发酵培养基含碳量有利于卡那霉素合成，为平衡碳氮比，研究降低发酵培养基含氮量对卡那霉素合成的影响，结果见表2.

表2降低发酵培养基含氮量对卡那霉素合成的影响

Table2Effectofreducingfermentationculturednitrogencontentonkanamycinsynthesis

序号蛋白胨/(g·L-1)豆饼粉/(g·L-1)NaNO3/(g·L-1)效价/(U·mL-1)对照55085898154046225253046485352045206451042149

由表2可见：黄豆饼粉从50 g/L降到30 g/L，NaNO3从8 g/L降到4 g/L，卡那霉素效价提高10%；黄豆饼粉质量浓度继续从30 g/L 降到10 g/L，效价不断下降.说明发酵培养基初始配方中黄豆饼粉30 g/L、NaNO34 g/L、蛋白胨5 g/L为最佳氮源组合.

由2.1和2.2的摇瓶发酵结果可见：降低初始碳和氮的质量浓度，不仅没有降低产量，卡那霉素的效价反而提高，说明发酵培养基可以降低组分浓度.

2.3 连续补料对卡那霉素合成的影响

抗生素是次级代谢产物，在发酵后期营养物质匮乏的情况下才能合成，但营养物质的缺乏又不能大量持久地合成抗生素.因此连续低浓度补料可以维持抗生素的长时间合成.发酵液pH的变化会影响各种酶活、基质利用速率和细胞结构，影响菌体细胞膜电荷状况，引起膜渗透性的变化，从而影响菌体对养分的吸收和代谢产物的分泌[5].因此控制好发酵液的pH值有利于卡那霉素合成.

为更好地进行连续补料发酵，对不补料发酵过程的工艺参数作图分析，结果见图1.

图1 不补料工艺的发酵曲线Fig.1 No feeding process of fermentation

由图1可见：在发酵18，42，66，85 h，通过4 次补水稀释发酵液，使溶解氧回升；发酵至96 h，pH高达7.9，糖和溶氧耗速率下降，卡那霉素效价增长趋缓，说明营养及环境条件不适合菌体合成卡那霉素，需要补料及代谢条件的平衡.

应用50 L自控发酵罐，按方法1.2.2发酵120 h.每6 h取样，通过斐林试剂法测定发酵液残糖含量.通过流加玉米淀粉水解液，控制发酵液总糖质量浓度在(25±5) g/L.通过自动流加氨水控制pH为6.8±0.05.发酵72 h后，依据维持较高的摄氧率流加酵母粉溶液.连续补料发酵结果见表3.

表3连续补料对卡那霉素合成的影响

Table3Effectofcontinuousfeedingonkanamycinsynthesis

批号放罐体积/L效价/(U·mL-1)效价提高率/%总产量×10-6/U增产率/%对照35．28520—300—02535．911673374194002637．110500233903002735．7113483340535平均36．2111743140535

取表3中025批次发酵罐的发酵参数作图，结果见图2.由表3和图2可见：采用补料工艺，控制发酵液pH，卡那霉素效价平均提高31%，最高达37%，总产量平均提高35%，最高增产率达40%.

图2 补料工艺的发酵曲线Fig.2 Feeding process of fermentation

2.4 延长发酵周期对卡那霉素合成的影响

分析图1,2两条发酵曲线发现：连续补料发酵至120 h时，发酵液中残留总糖和氨基氮含量仍较高，比较补料与不补料两种发酵过程中卡那霉素的效价及合成速率，结果见图3.

图3 连续补料与不补料发酵过程中卡那霉素效价与合成速率的变化Fig.3 Variation of kanamycin titer and synthesis rate in continuous and non-fed fermentation

由图3可见：不补料发酵工艺卡那霉素合成速率96 h后出现大幅下降，而流加补料工艺发酵至96～120 h，卡那霉素合成速率仍较高，达110 U/(mL·h)；发酵周期延长到144 h，卡那霉素合成速率仍在96 U/(mL·h)，再延长到168 h，卡那霉素发酵合成速率降低明显，因此卡那霉素补料工艺的最佳发酵周期为144 h.