镰刀菌毒素和改性蒙脱石吸附剂对全价饲粮发酵参数的影响

刘艳君 姜新超 李会荣 冯 蕾 杨在宾 杨维仁 姜淑贞 李祥明(山东农业大学动物科技学院，泰安 708)(中慧农牧股份有限公司昌乐分公司，潍坊 6400)(山东省饲料质量检验所，济南 500)

霉菌毒素是由霉菌产生的一类次生有毒代谢产物，其中的曲霉菌属、镰刀菌属和青霉菌属是产生毒素的最主要的霉菌[1]。镰刀菌可分泌多种毒素，主要是玉米赤霉烯酮、单端孢霉毒素、伏马毒素和呕吐毒素等[2]，是污染粮食的主要产毒霉菌之一，对畜禽的危害尤为严重[3]。随着我国养殖和饲料行业的迅速发展，利用微生物发酵技术来改善原料和饲料的营养价值，降解原料中的抗营养因子，提高饲料利用率，改善动物生产水平，是我国饲料工业的重点发展方向之一[4-5]。研究表明，混菌发酵霉变全价饲料，24 h后pH呈现明显的下降趋势，随着发酵深入，最终基本维持在平稳的水平[6]。利用乳酸菌和酵母菌发酵母猪全价配合饲料，粗灰分含量与对照组相比有所提高[7]，因此，发酵后使OM的含量降低。不同乳酸菌剂发酵全混合日粮，在各时间点NH3-N含量稳步上升[8]。在全株玉米青贮中添加不同类型的乳酸菌制剂pH显著降低，同时提高了乳酸含量[9]。国内外有关饲粮发酵研究主要集中在发酵改善常规饲料和原料的营养价值、降解原料中的抗营养因子，鲜见饲粮发酵对镰刀菌毒素污染饲粮添加改性蒙脱石吸附剂的研究报道。本实验旨在研究复合菌种(乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌分别为6.33×106、1.05×106、8.94×106cfu/g)发酵对镰刀菌毒素饲粮pH、OM、NH3-N和乳酸含量的影响，同时评价改性蒙脱石吸附剂对镰刀菌毒素饲粮发酵参数的影响，为生产中霉变饲料的处理提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

发酵菌种：乳酸菌(Lactobacillus)，5×109cfu/g；酵母菌(Yeast)，4.6×109cfu/g，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，1.9×1010cfu/g：北京科为博生物科技有限公司。

吸附剂(Calibrin-A，CA)，为焙烧改性蒙脱石吸附剂：美国Oil-Dri公司。

1.2 实验设计

实验分6个处理，每个处理6个重复，每个重复9桶。对照组(Contr.)为基础饲粮，实验1(25 Myco.)和2组(50 Myco.)分别用25%和50%的发霉玉米和发霉玉米蛋白粉代替基础饲粮中的玉米和玉米蛋白粉，实验3(Contr.+CA)、4(25 Myco.+CA)和5(50 Myco.+CA)组分别在基础饲粮、实验1和实验2组的基础上添加0.2%的CA。

1.3 实验饲粮与实验方法

1.3.1 实验饲粮的配制

断奶仔猪基础饲粮(Contr.)参考美国NRC(1998)营养需要配制，用发霉的玉米和玉米蛋白粉代替基础饲粮中的玉米和玉米蛋白粉配制成含有100%霉变饲粮，随后用100%霉变的镰刀菌毒素饲粮和对照饲粮按照1:3配制成25 Myco.饲粮，用100%霉变的镰刀菌毒素饲粮和对照饲粮按照1:1配制成50 Myco.饲粮。分别将Contr.、25 Myco.和50 Myco.饲粮与0.2%的CA混合均匀得到Contr.+CA、25 Myco.+CA和50 Myco.+CA饲粮。饲粮组成及营养水平见表2。饲粮发酵实验开始前将一定比例发酵菌种(乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌分别为6.33×106、1.05×106、8.94×106cfu/g)配制成水溶液，均匀喷洒在所有实验饲粮中，然后喷洒蒸馏水调节饲粮含水量至50%，搅拌均匀，装入塑料桶(50±0.36) kg，密封发酵，发酵温度控制在16～18 ℃。

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础)/%

注：1)每千克饲粮提供：VA 3 300 IU；VD3330 IU；VE 24 IU；VK30.75 mg；VB11.50 mg；VB25.25 mg；VB62.25 mg；VB120.026 mg；泛酸15.00 mg；尼克酸22.5 mg；生物素0.075 mg；叶酸0.45 mg；锰6.00 mg；铁150 mg；锌150 mg；铜9.00 mg；碘0.21 mg；硒0.45 mg。2)粗蛋白、钙和总磷为实测值，其他营养水平为设计值。

1.4 样品的采集与制备

饲粮密封前采样作为第0天的样品，然后分别于饲粮发酵的第6天(每个重复随机选择3桶，采样完毕弃去)、第12天(每个重复随机选择3桶，采样完毕弃去)和第18天(每个重复剩余的3桶)采集样品。采样方法：距离桶边约20 cm做一个圆，在圆上划一个“十”字，“十”字与圆的4个交点和圆心作为取样点；分别在距离发酵桶上表面约20 cm处、桶底约20 cm处和桶的中央采样，每个采样点采样约500 g，然后将每个桶的上、中、下15个点的样品混合，立即测定pH。按照四分法缩样，最后将样品平均分成2份(每份约500 g)，一份置于60 ℃烘箱中制成风干样，粉碎用于OM含量测定，另一份置于-20 ℃保存，用于NH3-N和乳酸含量测定。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 饲粮中霉菌毒素的检测

采用免疫亲和柱层析净化，以液相色谱法荧光检测器测定玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素和赭曲霉毒素的含量，外标法定量。采用免疫亲和层析净化高效液相色谱-串联质谱法，以液相色谱结合紫外检测器测定伏马毒素B1和B2、T-2毒素和呕吐毒素的含量，外标法定量。玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素、T-2毒素和呕吐毒素的最低检测限为分别为0.1 mg/kg、1.0 μg/kg、0.5 μg/kg、0.25 mg/kg、0.02 μg/kg和0.1 mg/kg，实验各组霉菌毒素含量见表2。

表2 实验各组镰刀菌毒素含量

1.5.2 pH测定

饲料中pH值测定采用Raclecki(1988)推荐的方法：称取20 g发酵饲料放入烧杯中加入40 mL去离子水，用玻璃棒搅拌均匀，形成浆状液，用pH计(便携式酸度计PHB-1，杭州齐威仪器有限公司)测定其pH值。

1.5.3 OM测定

参照GB/T 6438—2007粗灰分测定方法操作，OM=饲粮-粗灰分。

1.5.4 NH3-N测定

采用靛酚蓝比色法[10]，在强碱性介质中，氨与苯酚和次氯酸钠反应生成靛酚蓝，在以氨标准溶液做标准曲线，用分光光度计在625 nm下测定吸光度。

1.5.5 乳酸测定

乳酸(LD)测试盒(A019-2):南京建成生物工程研究所(南京)，具体处理和测定方法均按试剂盒说明书进行。

1.6 数据统计分析

实验数据采用SAS 9.2软件进行统计，用双因素方差分析和三因素方差分析进行统计分析。用Duncan’s多重比较，显著性水平为P<0.05。通过SPSS 17.0分析发酵各参数间皮尔逊相关系数。

2 结果与分析

2.1 对pH的影响

饲粮pH随发酵时间呈下降趋势(表3，P<0.05)，发酵到第12天基本稳定，所有处理第12和18天的pH差异不显著(P>0.05)。添加CA没有影响各时间点的pH(P>0.05)；但是与不添加CA相比，添加CA的全程平均pH显著降低(P=0.018)。毒素水平显著影响发酵0、12和18 d的pH(P<0.05)，发酵第0天时，对照组pH显著高于25%毒素组(P<0.05)，25%毒素组又显著高于50%毒素组(P<0.05)；发酵12 d和18 d，对照组pH则显著低于25%和50%毒素组(P<0.05)，而25%毒素组和50%毒素组差异不显著(P>0.05)。对照组发酵全程平均pH显著高于25%毒素组(P<0.05)，25%毒素组又显著高于50%毒素组(P<0.05)。发酵第0天，CA和镰刀菌毒素具有显著的交互作用(P<0.05)。

表3 发酵对饲粮pH的影响

注：同行肩注不同大写字母者，差异显著(P<0.05)，同列肩注不同小写字母者，差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 对OM的影响

饲粮OM随发酵时间呈下降趋势(表4，P<0.05)，发酵到第6天基本稳定，所有处理第6、12和18天的pH差异不显著(P>0.05)。添加CA没有影响各时间点和全程的平均OM(P>0.05)。毒素水平没有影响各时间点的平均OM(P>0.05)；但是对照组发酵全程平均OM显著低于50%毒素组(P=0.044)。CA和镰刀菌毒素对发酵各时间点和全程的平均OM均没有显著的交互作用(P>0.05)。

2.3 对NH3-N的影响

饲粮NH3-N随发酵时间呈上升趋势(表5，P<0.05)。添加CA没有影响各时间点和全程的平均NH3-N(P>0.05)。毒素水平显著影响发酵各时间点的NH3-N(P<0.05)，发酵第0天时，50%毒素组NH3-N含量显著低于25%毒素组(P<0.05)，25%毒素组NH3-N含量又显著低于对照组(P<0.05)；发酵第6、12和18天，对照组NH3-N含量显著低于25%和50%毒素组(P<0.05)，而25%毒素组和50%毒素组差异不显著(P>0.05)。对照组发酵全程的平均NH3-N显著低于25%毒素组和50%毒素组(P<0.05)。CA和镰刀菌毒素对发酵各时间点和全程的平均NH3-N均没有显著的交互作用(P>0.05)。

2.4 对乳酸的影响

饲粮乳酸随发酵时间呈上升趋势(表6，P<0.05)，发酵到第12天基本稳定。添加CA没有影响各时间点和全程的平均乳酸含量(P>0.05)。毒素水平显著影响发酵各时间点的乳酸(P<0.05)，整个发酵过程中，对照组乳酸含量显著高于25%毒素组(P<0.05)，而25%毒素组乳酸含量又显著高于50%毒素组(P<0.05)。对照组发酵全程的平均乳酸含量显著高于25%毒素组(P<0.05)，而25%毒素组乳酸含量又显著高于50%毒素组(P<0.05)。发酵0 d和12 d，CA和镰刀菌毒素具有显著的交互作用(P<0.05)。

表4 发酵对饲粮OM的影响/%

表5 发酵对饲粮NH3-N的影响/mg/g

表6 发酵对饲粮乳酸的影响/mmol/g

2.5 相关性分析

饲粮发酵各参数之间相关系数见表7。pH与OM呈显著正相关(P=0.028)，而与NH3-N(P=0.044)和乳酸(P=0.007)呈显著负相关。OM与NH3-N呈显著正相关(P=0.004)，而与乳酸呈显著负相关(P=0.018)。NH3-N和乳酸存在显著的正相关(P=0.022)。

表7 发酵参数之间的皮尔逊相关系数

3 讨论

关于全价饲粮发酵的研究，有些发酵全价饲粮[11]，有些则发酵原料[12]，但自然霉变的饲粮添加改性蒙脱石吸附剂的发酵实验尚鲜见报道。本实验饲料选择只含有镰刀菌毒素的自然霉变的玉米和玉米蛋白粉，因此，可以用于研究镰刀菌毒素和改性蒙脱石吸附剂对全价饲粮发酵参数的影响。

3.1 镰刀菌毒素对全价饲料发酵pH的影响

pH能综合地反映出发酵的进程。本实验结果表明，发酵初期，随着毒素含量升高，饲料中的pH逐渐降低，推测原因可能是串珠镰刀菌毒素通常以钠盐和钾盐形式存在的，其游离酸为强酸，pKa为0.0±0.05～1.7，化学性质属于半方酸阴离子，与无机酸性质类似[13-14]。李永凯等[15]表明：乳酸菌是一类能发酵可利用碳水化合物产生大量乳酸的细菌。李绍章[16]等实验也证明了发酵饲料中乳酸的含量变化与pH值的变化规律一致。本实验结果发酵末期对照组pH(<4.5)达到良好饲料标准[17-18]。而镰刀菌生长消耗大量营养物质，致使发酵过程中产酸能力相对降低[19-20]，因而造成毒素组pH较高(4.57～4.63)。

3.2 镰刀菌毒素对全价饲料发酵OM的影响

有机化合物含量是鉴别发酵饲料品质的常用指标之一[21]。杨旭等[22]采用固体发酵研究发酵对豆粕养分的影响表明，发酵后OM含量降低。高白茹等[23]也证明秸秆和秸秆残渣经过厌氧发酵后OM含量降低，与本实验的研究一致。但OM降低程度各不相同，这与发酵底物、发酵菌种和发酵温度有关。尽管本研究毒素水平没有显著影响各时间点的平均OM，但是与发酵初始(0 d)相比，对照组、25%毒素组和50%毒素组OM分别降低了1.29%、1.15%和0.90%，而且对照组发酵全程平均OM显著低于50%毒素组，说明毒素影响了微生物发酵OM的能力，但其机理尚需进一步实验证实。

3.3 镰刀菌毒素对全价饲料发酵NH3-N的影响

NH3-N是衡量饲料质量优劣的重要指标之一，饲料中的氨氮过量，将会影响动物体内的正常生理活动甚至生存[24]。研究表明，细菌、放线菌和霉菌对猪粪发酵过程中的NH3-N释放具有良好的抑制作用[25]。本实验结果也表明，全价饲粮发酵初期，随着毒素含量升高，饲料中的NH3-N含量逐渐降低，推测可能是镰刀菌毒素对饲料中的NH3-N进行了抑制或者镰刀菌与饲料本身的其它菌共同作用抑制了NH3-N产生。NH3-N是饲料中蛋白质、氨基酸和其他非蛋白氮化合物等分解的终产物[26]。组合菌种在发酵过程中分解蛋白质变成氨，然后利用氨合成自身的菌体蛋白，这个过程中不是所有的氨都能被利用，最终导致发酵饲粮NH3-N浓度上升。本研究饲粮NH3-N的产生随毒素水平升高而升高，与发酵初始(0天)相比，对照组、25%毒素组和50%毒素组NH3-N分别增加了281%、644%和1022%，对照组发酵全程的平均NH3-N显著低于25%毒素组和50%毒素组。但是毒素影响NH3-N释放的机理尚需进一步证实。

3.4 镰刀菌毒素对全价饲料发酵乳酸的影响

乳酸的产生，可以使总酸度提高，从而抑制了腐败菌等有害菌的繁殖，有利于发酵饲料的长期保存[27]。酵母菌和枯草芽孢杆菌可以分泌α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等多种胞外酶[28]，分解营养物质，生成糖类。在酵母菌和枯草芽孢杆菌帮助下，乳酸菌可利用这些碳水化合物发酵产生大量乳酸[29]，比单一乳酸菌发酵产生乳酸能力更高。本研究中，发酵末期(18 d)对照组、25%毒素组和50%毒素组的乳酸含量分别为发酵初始(0 d)的28.41、32.4和74.1倍。冯德明等[30]研究表明，主要以酵母菌和乳酸杆菌发酵生产黄酒过程中，乳酸含量随着时间逐渐增加。崔彦召[31]也证明，运用不同的乳酸菌剂对全混合日粮进行发酵，各组乳酸含量逐渐增加，与本实验结果一致。本研究发酵末期饲粮乳酸含量随毒素水平升高而显著降低，对照组发酵全程的平均乳酸含量显著高于25%毒素组，而25%毒素组乳酸含量又显著高于50%毒素组。但是毒素影响乳酸产生的机理尚需进一步证实。

3.5蒙脱石吸附剂对镰刀菌毒素全价饲料发酵参数的影响

蒙脱石吸水性很强，吸水后膨胀，蒙脱石在水介质中可分散呈胶体状态，即晶格底面间距增大，在高水化状态时晶轴C0可达1.84～2.14 nm[32]。因此推测蒙脱石吸附饲料中的部分水分间接引起H+升高，导致酸度降低。本实验条件下，添加CA的全程平均pH显著低于不添加CA组。镰刀菌毒素和CA对发酵12 d的乳酸具有显著的交互作用。

4 结论

4.1 本实验条件下，饲粮pH和OM含量随发酵时间显著下降，而NH3-N和乳酸水平随发酵时间显著升高。

4.2 饲粮(0 d)的pH和NH3-N水平均随镰刀菌毒素水平升高显著降低。发酵末期(18 d)饲粮pH随毒素水平升高显著升高；对照组NH3-N显著低于两个毒素组；而乳酸含量随毒素水平升高显著降低。发酵全程平均的pH和乳酸含量随毒素水平升高显著降低；对照组发酵全程的平均OM显著低于50%的毒素组；对照组发酵全程的平均NH3-N显著低于两个毒素组。

4.3 添加CA的全程平均pH显著低于不添加CA组。

4.4 镰刀菌毒素和CA对发酵第12天的乳酸具有显著的交互作用。

4.5 pH与OM、OM与NH3-N、NH3-N和乳酸呈显著正相关，而pH与NH3-N、pH与乳酸、OM与乳酸呈显著负相关。

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