杏子酸味烟用香料靶向组分的确定及制备工艺优化

张文娟，张国臣，王宏伟，陈芝飞，徐秀娟，屈展，蔡莉莉，徐海伟，洪广峰，于建春

1 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州市高新技术开发区枫杨街2号，450001；2 郑州大学药学院，郑州市高新技术开发区科学大道100号，450001；3 河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州市经济技术开发区第三大街8号，450016

杏(Armeniaca vulgarisL.)原产于我国，属蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)杏属(ArmeniacaMill.)，其果实提取物是国内外烟草行业允许使用的一种常用卷烟添加剂[1-2]。有文献报道，杏子富含有机酸，其提取物可抑制卷烟刺激性，改善口感舒适性，且其含有的多种香味物质是烟草重要致香成分，可与烟香谐调，提高卷烟香气品质[3-4]。但是目前关于杏子提取物烟用香料研究较少。感官导向分析法是食品科学研究领域从复杂体系中寻找感官活性成分的常用方法之一[5-10]，利用该方法可以获得与食品嗅觉、味觉特征有直接因果联系的关键成分。在烟用香料研发领域，以卷烟感官作用评价为导向，定位增加卷烟烟气香韵或改善感官舒适性的特征流份，探索烟用香料成分与卷烟烟气特定感官特征之间的因果联系，对优化天然烟用香料的制备工艺和开发特色烟用香料有重要意义。近年来，本项目组基于感官作用评价方法对初烤烟叶中的关键酸味成分[11]、甜味成分[12]，以及卷烟主流烟气中的烤甜香成分[13]、苦味成分[14]和烟熏香成分[15]进行了研究，并根据上述研究结果，以红枣[16]和焦麦芽[17]为例，开展天然烟用香料的制备工艺优化研究，得到了烤甜香关键成分含量高且卷烟加香效果好的红枣和焦麦芽烟用香料。有机酸与卷烟烟气吸味关系密切[18]，为此，利用超滤和凝胶渗透色谱(GPC)分离杏的30%乙醇提取物，通过卷烟感官作用评价确定能够改善卷烟感官舒适性的靶向组分，并以靶向组分中7种主要有机酸的含量(质量分数)为指标对杏子提取物制备工艺进行优化，旨在为开发具有改善卷烟感官舒适性作用的天然酸味烟用香料提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

新鲜杏(2014年6月购于郑州市水果市场，产地为甘肃)；杏子提取物(购自上海某香料公司)；“黄金叶”某规格空白卷烟(河南中烟工业有限责任公司提供)。

富马酸、琥珀酸、无水吡啶(≥99%)、柠檬酸(99.5%)、乳酸(85%)(比利时Acros Organics公司)；羟基乙酸(99%，北京百灵威科技有限公司)；反式-2-己烯酸(≥98%)、甘油酸(20%的水溶液)(梯希爱上海化成工业发展有限公司)；苹果酸(≥99%，美国Sigma-Aldrich Fluka公司)；N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，上海安谱实验科技股份有限公司)；无水乙醇(色谱纯，德国Merck公司)；95%乙醇(AR，天津市科密欧化学试剂有限公司)；超纯水(河南省骁绮水业有限公司)；LH-20羟丙基葡聚糖凝胶(美国GE公司)；高纯氮气(河南科益气体股份有限公司)。

7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司)；BSZ-160型自动流份收集器(上海精密科学仪器有限公司)；ALPHA 1-2 LD plus冻干机(德国Christ公司)；小型切向膜分离系统，0.22 μm PVDF (Polyvinylidene fluoride)微 滤 膜 (50 cm2)，5、8和10 kD的PES (Polyethersulfone)超滤膜(美国Millipore公司)；涡旋仪(德国IKA公司)；CPA225D电子天平(感量0.00001 g，德国Sartorius公 司 )；V-850 旋 转 蒸 发 仪 (瑞 士 Büchi公 司 )；HF-5B超声循环提取机(北京弘祥隆生物技术开发有限公司)；CIJECTOR卷烟加香注射机(德国Burghart公司)。

1.2 方法

1.2.1 杏子粗提物的制备

称取新鲜杏1153.2 g，洗净后去核破碎，得923.1 g，以1:3的料液比(质量比)加入30%(体积分数)乙醇，加热至65 ℃提取2.0 h，共提取两次。合并两次浸提液，减压浓缩至膏状，得到142.94 g杏子粗提物。

1.2.2 杏子粗提物中靶向组分的确定

1.2.2.1 膜分离

称取一定量杏子粗提物，加入10倍质量的30%乙醇，振荡至充分溶解，6000 r/min下离心20 min；取上清液，用0.22 μm PVDF微孔滤膜过滤，泵压100 kPa (1 bar)；收集透过液，用截留分子量为10 kD的PES超滤膜过滤，泵压140 kPa (1.4 bar)，回流管路压力70 kPa (0.7 bar) ；收集透过液，浓缩后冷冻干燥。

1.2.2.2 GPC分离

称取5.9764 g冻干物，加入15 mL超纯水，振荡溶解后进行GPC分离。采用湿法上样，超纯水洗脱，流速3 mL/min，以6 mL/管收集洗脱液，共收集80管，紫外检测波长210 nm和360 nm。由10位评委通过直接品尝的方式，对各流份的味觉特征进行评价，若有7位及以上评委意见一致，则判定评价结果可以接受，否则进行二次分离。合并味觉特征相同的流份，浓缩、冷冻干燥，得到酸味、酸甜味、甜味、苦味4个组分。对未被有效分离的酸甜组分进行二次分离，得到酸味、甜味两个组分，并分别与第1次分离得到的酸味、甜味组分合并。

1.2.2.3 靶向组分确定

经两次GPC分离、味觉评价，得到了“甜”、“酸”、“苦”3个组分；分别进行卷烟感官作用评价，以改善舒适性效果最好的组分确定为杏子粗提物靶向组分。

1.2.3 杏子粗提物靶向组分的成分检测

1.2.3.1 定性分析

称取30 mg杏子粗提物靶向组分，加入1 mL无水吡啶和150 μL BSTFA，60 ℃下衍生化反应1 h，反应结束后直接进行GC/MS分析。GC/MS条件：

色谱柱：DB-5ms毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)； 载 气：He，99.999%； 流 速：1.0 mL/min；进样口温度：250 ℃；进样量：1 μL；进样模式：分流进样，分流比10:1；升温程序：起始温度50 ℃，以5 ℃/min升至200 ℃，保持12 min，再以10 ℃/min升至280 ℃；传输线温度：250 ℃；离子源：电子轰击(EI)；电离能量70 eV；离子源温度230 ℃；扫描模式：全扫描；质量扫描范围：33～500 amu.；溶剂延迟：9 min。通过NIST11谱库比对，以匹配度≥80%者定性。

1.2.3.2 定量分析

(1) 溶液配制。①内标储备液：准确称取50 mg反式-2-己烯酸，用无水吡啶溶解并定容于25 mL容量瓶中，得浓度为2 mg/mL的内标储备液。②内标萃取液：准确移取内标储备液1250 μL于250 mL容量瓶中，用无水吡啶稀释并定容，得到10 μg/mL的内标萃取液。③标准储备液：准确称取乳酸176.5 mg、羟基乙酸8.0 mg、琥珀酸50.0 mg、甘油酸20.0 mg、富马酸20.0 mg、苹果酸2000.0 mg、柠檬酸2000.0 mg，用内标萃取液溶解并定容于250 mL容量瓶中。④标准工作溶液：分别移取10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL 和 1 mL 的标准储备液于10 mL容量瓶中，用内标萃取液稀释并定容，得到7级标准工作溶液。

(2) 衍生化。参考文献[11]的方法进行衍生化反应和分析。具体操作步骤：分别平行移取7级标准工作溶液各5份，每份l mL，分别加入90 μL BSTFA试剂，60 ℃下反应50 min；准确称取50 mg杏子提取物，用内标萃取液溶解并定容至10 mL，取1 mL溶液加入100 μL BSTFA试剂，于60 ℃下反应50 min；反应结束后进行GC-MS分析。

(3) GC/MS分析。采用内标标准曲线法对靶向组分中定性出的有机酸进行定量分析。气相色谱条件与1.2.3.1节相同，采用选择离子扫描(SIM)模式。目标物衍生化产物的保留时间及定性、定量离子的参数选择见表1。

表1 7种目标物及内标衍生化产物的保留时间和定性、定量离子Tab.1 Retention times, qualitative and quantitative ions of derivatives of seven analytes and internal standard

1.2.4 杏子酸味烟用香料制备工艺的优化

1.2.4.1 加热浸提法工艺参数

采用单因素实验法对乙醇浓度(0%、10%、20%、30%、40%和50%)，提取温度(45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃和 85 ℃ )，提取时间 (1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h)和料液质量比(1:3、1:4、1:5、1:6和1:7)等4个因素进行考察。

1.2.4.2 膜分离工艺参数

利用超滤技术对杏子粗提物分离精制，采用单因素实验法对超滤膜孔径(截留分子量5、8和10 kD)和料液干物质含量(1%、2%、3%和4%)两个主要影响因素进行考察。

1.2.5 卷烟感官作用评价

用10%乙醇配制质量分数为1%的待评价样品溶液，并向每支空白卷烟中注射4.0 μL(加香量为0.005%)。参比卷烟为注射等量10%乙醇的空白卷烟。加香后的样品卷烟和参比卷烟分别于(22±1)℃、相对湿度(60±3)%条件下平衡48 h，参照YC/T 496—2014《卷烟 感官舒适性评价方法》进行感官评价。评价结果取平均值。

2 结果与讨论

2.1 杏子粗提物中靶向组分的确定

GPC按照分子体积进行分离，且通常以水为流动相，适合于香气或味觉特征相似分子的有效分离和富集，因此，GPC是感官导向分析研究的常用分离手段[7-11]。由于杏子粗提物中含有较多的果胶、蛋白质等，对卷烟感官质量有不良影响，因此首先采用膜分离技术去除这些大分子物质，然后采用GPC技术进行进一步分离。因经洗脱溶剂稀释后的各分离流份已无明显的嗅香特征，故先通过味觉评价对其进行初步合并，再通过卷烟感官作用评价筛选出对改善卷烟感官舒适性有显著效果的组分作为靶向组分。

杏子粗提物第1次GPC分离的流份按味觉特征可分为4组(表2)。组分2经过GPC二次分离，得到的各流份按味觉特征可分为两组(表3)。由表2和表3可知，组分1和组分2-1为甜味组分，总质量为3.6082 g，组分2-2和组分3为酸味组分，总质量为0.9355 g。

表2 杏子粗提物初次GPC分离组分的味觉评价结果①Tab.2 Taste evaluation results of first GPC separation fractions of apricot crude extract

表3 杏子粗提物组分2的GPC分离结果①Tab.3 GPC separation results of fraction No.2 of apricot crude extract

杏子粗提物、酸味组分、甜味组分、苦味组分的卷烟舒适性感官评价结果见表4和图1。可以看出，在改善卷烟感官舒适性方面，杏子粗提物及其3种GPC分离组分均有不同程度的效果，其中酸味组分明显优于杏子粗提物，前者总体感受得分比后者提高了0.23分；在改善卷烟圆润感、柔和烟气、降低刺激和干燥感等方面，酸味组分的效果尤为突出，提扬酸味和甜味的味觉效果较好；甜味组分和苦味组分均不如杏子粗提物，前两者总体感受得分比后者降低了0.13分和0.07分。因此，确定杏子粗提物GPC分离组分中的酸味组分为杏子粗提物的靶向组分。

表4 杏子粗提物及其GPC分离组分的卷烟感官舒适性评价结果①Tab.4 Cigarette sensory comfort evaluation results of apricot crude extract and its GPC separation fractions 分

续表4

图1 杏子粗提物及其GPC分离组分卷烟感官质量对比Fig.1 Comparison of cigarette sensory quality of apricot crude extract and its GPC separation fractions

2.2 靶向组分的成分分析结果

杏子粗提物中靶向组分的GC/MS分析结果(图2和表5)显示，靶向组分主要包括乳酸、羟基乙酸、琥珀酸、甘油酸、富马酸、苹果酸和柠檬酸等7种有机酸，其中，柠檬酸和苹果酸的含量较高。将这些酸性成分施加于卷烟中可使烟气变得柔和，刺激性和干燥感降低，从而使卷烟感官舒适性提高。

图2 杏子粗提物中靶向组分衍生化后的总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of derivative targeted components of apricot crude extract

表5 杏子粗提物中靶向组分的主要化学成分Tab.5 Major chemical components in targeted fraction of apricot crude extract

续表5

2.3 靶向组分的定量分析结果

将7个浓度梯度的标准工作溶液进行衍生化反应，然后进行GC/MS分析，以目标物浓度与内标浓度的比值作为横坐标(x)，以目标物与内标峰面积的比值作纵坐标(y)，得到各目标物的标准工作曲线(表6)。由表6和标准样品溶液的总离子流色谱图(图3)可以看出，各目标物的回归方程线性良好，适合定量分析。

表6 7种目标物的标准工作曲线Tab.6 Standard curves of seven analytes

图3 7种目标物标样溶液的总离子流色谱图Fig.3 Total ion chromatogram of standard solution containing seven analytes

2.4 杏子酸味烟用香料的制备工艺优化

2.4.1 提取工艺参数的优化

提取方法及工艺参数对提取物中感官特征成分的含量有决定性影响。在前期研究中比较了循环超声提取法和加热浸提法对杏中7种有机酸提取效果的影响，确定了溶剂加热浸提法，并以7种有机酸含量为指标，对其主要工艺参数(乙醇浓度、提取温度、提取时间和料液质量比)进行了优化，结果如图4所示。由图4可以看出：①随着乙醇浓度的增加，7种有机酸含量先增加后降低，30%乙醇提取效果最好，这与杏子粗提实验时卷烟感官作用评价的结果一致。②随着提取温度的升高，7种有机酸含量增加，75 ℃条件下的提取效果最好。③随着提取时间的延长，7种有机酸含量先增加，2.0 h后趋于稳定。④随料液质量比的增大，7种有机酸含量先增加后降低，1:5时效果最好。

图4 不同因素对杏子提取物中7种有机酸含量的影响Fig.4 Effects of different factors on contents of seven organic acids in apricot extract

综上所述，通过单因素实验确定杏子中有机酸类成分的最优提取工艺为30%乙醇、料液质量比1:5、提取温度75 ℃、提取时间2.0 h、提取次数2次。采用优化的提取工艺制备杏子提取物的提取率为10.32%（干基计），其中7种有机酸总含量为131.63 mg/g。

2.4.2 膜分离工艺参数的确定

本研究中考察了超滤膜孔径(截留分子量5、8和10 kD)和料液干物质含量(1%、2%、3%和4%)两个主要膜分离工艺参数对7种有机酸透过率的影响。结果(图5)表明：①随着超滤膜孔径的增大，超滤透过液中7种有机酸的含量（干基计）呈下降趋势，其中10 kD降幅较大；有机酸总透过率呈现小幅度的增加，其中10 kD与8 kD的有机酸总透过率基本相当；膜通量明显增大，从 18.62 L/m2·h 增至 56.84 L/m2·h，膜通量越大，能耗和时间成本均会降低。综合考虑上述各因素，选择膜孔径8 kD。②随着料液干物质含量的增大，超滤透过液中7种有机酸的总含量（干基计）先增加后降低，在料液干物质含量为2%时达到最大值；7种有机酸总透过率基本呈现下降趋势；膜通量随着料液干物质含量的增加呈降低趋势。综合考虑上述各因素，选择料液干物质含量2%。

图5 超滤膜孔径和料液干物质含量对膜通量、7种有机酸透过率及含量的影响Fig.5 Effects of ultrafiltration membrane' s pore size and dry matter content in apricot extract on membrane flux, transmittance and contents of seven organic acids

综上所述，通过单因素实验确定的膜分离工艺参数为超滤膜孔径8 kD、超滤前料液干物质含量2%。在优化的膜分离工艺条件下，7种有机酸总透过率为93.58%，膜通量为25.41 L/(m2·h)，7种有机酸总含量为154.99 mg/g（干基计）。

2.5 与市售样品比较

采用建立的7种有机酸定量检测方法，对比分析市售的杏子提取物、实验过程中制备的“杏子粗提物”和靶向制备的“杏子酸味香料”中7种有机酸的含量，结果如表7所示。可以看出，“杏子酸味香料”中目标物总含量最高，较“杏子提取物（市售）”和“杏子粗提物”分别高出103.601 mg/g和26.079 mg/g。

杏子提取物(市售)、杏子粗提物及杏子酸味香料的卷烟感官舒适性评价结果(表8)显示，添加3种杏子提取物的卷烟的各舒适性指标均优于参比卷烟，表明三者在改善卷烟舒适性方面均有不同程度作用；与杏子提取物（市售）和杏子粗提物相比，杏子酸味香料在改善卷烟舒适性方面效果最佳，其总体感受得分较前两者分别提升0.32和0.25分，在改善卷烟圆润感、柔和烟气、降低刺激和干燥感等方面的效果更为突出，提扬酸味和甜味的效果更好。

表7 3 种杏子提取物中7种有机酸含量对比Tab.7 Content comparison of seven organic acids in three apricot extracts mg/g

表8 3种杏子香料的卷烟感官舒适性评价结果Tab.8 Sensory comfort evaluation results of three test cigarettes with addition of three apricot flavors

3 结论

通过采用GPC分离、卷烟感官作用评价、GC/MS等方法，确定了杏子粗提物中的酸味靶向组分，该组分主要包括苹果酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、富马酸、甘油酸和羟基乙酸等7种有机酸。以靶向组分为指标优化确定的溶剂加热浸提法提取工艺参数为30%乙醇、料液质量比1:5、提取温度75 ℃、提取时间2.0 h；膜分离工艺参数为超滤膜截留分子量8 kD、超滤前料液干物质含量2%。采用优化工艺制备的杏子酸味烟用香料中靶向组分的含量高于市售杏子提取物和杏子粗提物，且对改善卷烟感官舒适性的效果最好。本研究结果可为天然酸味烟用香料的开发提供参考。

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