结节性硬化症一家系表型异质性分析

陈 丽,石 真,延会芳,冀浩然,王静敏*

(1北京大学第一医院儿科,北京 100034;2首都医科大学附属北京安贞医院小儿心脏中心;*通讯作者,E-mail:wang66jm@163.com)

结节性硬化症(tuberous sclerosis complex,TSC)是一种常染色体显性遗传病,于1888年由Magloire Bourneville首次报道,因此该病又称为Bourneville病[1]。其属于多系统受累的神经皮肤综合征,主要临床特征为面部皮脂腺瘤、癫痫和智力障碍,同时还可累及其他脏器和组织如肾脏、视网膜、心脏和肺等[2],严重影响患儿的身心健康及生活质量。其在活产婴儿中的患病率约为1/9 000-1/6 000[3]。TSC的致病基因分别为9q34和16p13的TSC1和TSC2,二者分别编码错构瘤蛋白(hamartin)以及马铃薯球蛋白(tuberin),这两种蛋白质于体内形成hamartin-tuberin复合体[4-6],可抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路(m-TOR pathway),从而调控细胞生长和增殖[7,8]。TSC1和TSC2突变缺陷引起的临床表现十分类似,突变检出率约为80%左右[9],其中TSC2高于TSC1。随着分子遗传学检测技术的不断进步,对TSC进行遗传学病因的早期诊断成为了可能,从而对TSC患者制定个体化治疗方案并进行密切随访对改善患者的预后具有重要临床意义,本研究将通过对TSC一家系中5例患者表型-基因型分析,明确其遗传学与表型异质性特征,为准确的遗传咨询及产前诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

家族系谱图如图1所示:先证者(Ⅲ:4,见图1),男,24岁,主因间断抽搐11年于2017年2月8日就诊于北京大学第一医院儿科门诊。患儿11年前睡眠中出现口角歪斜,四肢僵硬,呼之不应,持续约1 min。当地医院视频脑电图提示右侧半球、右侧中央顶、中后颞区放电,诊断“癫痫”,予奥卡西平口服治疗,13岁共发作3次,18岁发作两次,18岁时于我院门诊查体发现皮肤多处色素脱失斑,查头颅MRI示右侧颞区灰白质交界处异常信号(见图2),符合TSC的临床诊断标准,进而临床诊断TSC,予氯硝西泮4片/次,每晚1次及丙戊酸钠1.5片/次,每晚1次口服治疗癫痫,至今未有发作。既往史无特殊。个人史:G2P1,出生体质量3.9 kg,母亲孕中期皮肤感染,口服抗生素2个月,否认糖尿病、高血压史。生长发育正常,成绩不佳。

先证者父(Ⅱ:3)母(Ⅱ:4)非近亲婚配,Ⅱ:3表型正常。Ⅱ:4,女,44岁,抽搐不明显,曾有1次不明原因晕厥,查体右侧腰部可见牛奶咖啡斑1块。先证者之弟(Ⅲ:6),男,10岁。1岁半开始出现抽搐,共有3种发作形式:最初表现为眨眼后强直痉挛发作;2岁半出现第二种发作形式,表现为腹部不适,双手抚摸腹部,愣神,持续数秒至1 min,清醒及睡眠中均有发作;4岁出现第三种发作形式,表现与先证者类似,当地医院诊断“癫痫”,予多种抗癫痫药物治疗,效果不佳。查体左上肢可见条形色素脱失斑,右侧腰部可见牛奶咖啡斑。既往史无特殊。个人史:母孕期正常,足月剖宫产,生后有缺氧史。生长发育正常。家族史:哥哥有TSC病史,至今服药控制良好。辅助检查:头颅MRI示双额叶及右颞及左顶叶可见多发大小不等片状长T2信号影,Flair呈稍高信号(见图3),考虑结节性硬化可能性大。视频脑电图示弥漫性慢波,间歇期放电弥漫性,中线区显著。24 h脑电图(-)。先证者之女(Ⅳ:1),女,2岁,目前尚无癫痫发作,查体皮肤无异常,超声心动图示心脏横纹肌瘤。先证者之外祖父(Ⅰ:1),男,73岁,临床表型正常。家族中其他成员否认类似临床表现。

图1 结节性硬化症一家系图谱Figure 1 A family tree of tuberous sclerosis complex

A.轴位 B.冠状位 C.矢状位图2 先证者2007年头颅MRI T2 flair像显示右颞上回后部灰白质交界处高信号影(箭头)Figure 2 MRI T2 flair showed the right superior temporal gyrus of proband (2007) had a high signal at the junction of gray and white matter(arrows)

A.双侧额叶 B.左侧顶叶 C.右侧颞叶图3 先证者之弟2013年头颅MRI T2 flair像显示双侧额叶、左侧顶叶及右侧颞叶高信号影(箭头)Figure 3 MRI T2 flair showed the bilateral frontal lobe(A), left parietal lobe(B) and right temporal lobe(C) of proband's brother all had high signal

1.2 研究方法

1.2.1 实验方法

1.2.1.1 采集标本 采集患儿及其家系成员外周静脉血各3 ml,采用FlexiGene DNA Kit提取试剂盒(德国Qiagen公司)提取DNA,-80 ℃保存待用。

1.2.1.2 目标基因靶向捕获-高通量测序 利用Agilent SureDesign在线设计工具,设计针对TSC1和TSC2外显子及侧翼序列(±10 bp)的靶向捕获探针。采用Agilent SureSelect Target Enrichment System Kit目标序列富集试剂盒对先证者的DNA样本制备目标基因捕获文库,使用Agilent Bioanalyzer 2100仪器对测序文库的DNA样本进行检测,应用NEXT-SEQ 500测序仪(美国Illumina公司)上机测序。测序平台产生的原始数据Fastq文件经RTA software (real-time analysis,Illumina公司)、CASAVA software v1.8.2(Illumina公司)、BWA、Genome Analysis Toolkit(GATK)生物信息学软件分析后,评估测序质量,生成单核苷酸变异(single nucleotide variation,SNV)报告。运用PolyPhen-2.2.2软件、ANNOVAR软件、HGMD数据库、dbSNP数据库、1000 Genome数据库进行变异注释,选出候选变异。

1.2.1.3 Sanger测序 根据人类基因组数据库GenBank中获得的TSC2(NM-000548)序列,应用Primer Premier 5.0设计分别针对候选变异TSC2 c.1880A>C和TSC2 c.3883+3A>G的2对引物,通过PCR扩增、Sanger测序对患儿父母及胞弟进行变异位点验证。

1.2.1.4 变异位点保守性分析 在UCSC数据库(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)定位到TSC2两个变异位点的位置,查看变异位点所对应氨基酸在不同物种中的保守性。

1.2.2 TSC诊断标准

1.2.2.1 基因诊断标准[10,11]证实存在TSC1或TSC2的致病性突变,即可明确诊断本病。

1.2.2.2 临床诊断标准[10,11]把TSC的主要表现分为主要指标(11项)和次要指标(6项)。至少满足2项主要指标或1项主要指标加2项次要指标可以确定诊断TSC,满足1项主要指标或2项次要指标则为可能诊断。主要指标包括:①色素脱失斑(>3处,直径≥5 mm);②面部血管纤维瘤(≥3处)或头部纤维斑块;③指(趾)甲纤维瘤(≥2处);④鲨皮样斑;⑤多发性视网膜错构瘤;⑥脑皮层发育不良(包括皮质结节和白质放射状移行线);⑦室管膜下结节;⑧室管膜下巨细胞星形细胞瘤;⑨心脏横纹肌瘤;⑩肺淋巴管肌瘤病(如果和血管平滑肌脂肪瘤同时存在,则合并为1项主要指标);血管平滑肌脂肪瘤(≥2处)。次要指标包括:①“斑斓”皮损;②牙釉质点状凹陷(>3处);③口内纤维瘤(≥2处);④视网膜色素脱失斑;⑤多发性肾囊肿;⑥非肾性错构瘤。

2 结果

2.1 临床特点

该家系中患者的主要临床表现包括癫痫、皮肤改变、心脏横纹肌瘤以及TSC典型的头颅MRI改变,先证者(Ⅲ:4)及胞弟(Ⅲ:6)以癫痫及皮肤改变为主,头颅MRI呈TSC特征性改变,符合临床诊断TSC,先证者之母(Ⅱ:4)表现皮肤改变,之女(Ⅳ:1)存在心脏横纹肌瘤,之外祖父(Ⅰ:1)否认存在上述临床表现。先证者之母、之女及之外祖父均不符合TSC的临床诊断标准。其余家族成员(Ⅰ:2,Ⅱ:3,Ⅱ:5,Ⅱ:6,Ⅱ:7,Ⅲ:1,Ⅲ:2,Ⅲ:3,Ⅲ:5,Ⅲ:7)临床表型正常。

2.2 遗传学结果

先证者(Ⅲ:4)发现TSC2存在c.1880A>C杂合错义改变以及c.3883+3A>G疑似剪接改变(见图4),患者的两个变异均为国际上未见报道的新突变,前者导致第627号氨基酸由His变为Pro(p.His627Pro),该位点参与组成的氨基酸在人类、小鼠、恒河猴中高度保守,在人群频率数据库中未见该位点突变的报道;后者在人类、小鼠、恒河猴中高度保守,在人群中发生频率极低,用软件预测为多态,由于其未发生在经典剪接突变的位置,可能为该家系范围内遗传的单核苷酸多态变化,致病意义不明,需后期采集患者血液进行mRNA验证或者进行体外功能实验。先证者之胞弟(Ⅲ:6)、之母(Ⅱ:4)、之女(Ⅳ:1)及之外祖父(Ⅰ:1)均发现TSC2相同位点变异,其余家族成员(Ⅰ:2,Ⅱ:1,Ⅱ:3,Ⅱ:5,Ⅲ:5)上述两位点为野生型(见图4)。

3 讨论

TSC是一种以多器官的组织缺陷和错构瘤为特征的常染色体显性遗传性神经皮肤综合征,可累及多个系统损害,主要累及皮肤、神经系统、肺、血管平滑肌及全身其他系统[6,12]。皮肤改变主要包括色素脱失斑、面部血管纤维瘤、指(趾)甲纤维瘤及鲨鱼皮样斑。神经系统改变主要表现为癫痫、智力低下和精神行为障碍、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、肢体瘫痪、共济失调以及运动障碍等症状。肺组织损伤主要表现为肺淋巴管肌瘤病,可致患者出现气短、咳嗽、胸痛等。血管平滑肌损伤主要表现为血管平滑肌脂肪瘤,常见于肾脏,也可发生在肝、肾上腺、脾等。心脏损伤方面,约2/3的患者存在心脏横纹肌瘤,宫内或出生后不久发生,多数没有症状,部分早期可自行消退。典型表现为生后不久出现心力衰竭,个别为横纹肌肉瘤。眼底常见椹状星形细胞瘤或斑块状错构瘤和无色素区域。视网膜错构瘤也是本病重要的体征之一。其他临床表现有骨囊肿、胃肠道病变等。本研究TSC患者的主要临床表现包括癫痫、皮肤改变、心脏横纹肌瘤以及典型的头颅MRI改变。先证者(Ⅲ:4)及其胞弟(Ⅲ:6)以癫痫及皮肤改变为主,累及神经系统及皮肤,且头颅MRI呈TSC特征性改变,符合TSC的临床诊断标准[10,11];先证者之母(Ⅱ:4)表现皮肤改变,之女(Ⅳ:1)存在心脏横纹肌瘤,累及心脏,之外祖父(Ⅰ:1)否认存在上述临床表现。根据TSC的临床诊断标准[10,11],先证者之母、之女及之外祖父均不满足临床诊断TSC。此家系中其他家族成员(Ⅰ:2,Ⅱ:3,Ⅱ:5,Ⅱ:6,Ⅱ:7,Ⅲ:1,Ⅲ:2,Ⅲ:3,Ⅲ:5,Ⅲ:7)临床表型正常。由于TSC患者存在多器官的缺陷,因此TSC患者的临床表型呈现异质性。

图4 先证者及其母亲、父亲、外祖父、胞弟测序图结果及突变位点在物种中的保守性分析

Figure 4 The outcome of sequencing in proband, his mother, his father, his grandfather and his younger brother, and the conservative property of mutation sites

TSC的致病基因为TSC1和TSC2,二者分别编码错构瘤蛋白(hamartin)以及马铃薯球蛋白(tuberin),这两种蛋白质于体内形成hamartin-tuberin复合体[4-6],可抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路(m-TOR pathway),从而调控细胞生长和增殖[7,8]。2个基因突变缺陷引起的临床表现十分类似,且TSC2突变高于TSC1,目前已发现318种TSC1突变及1 012种TSC2突变(HGMD数据库)。对TSC患者进行基因分析,可发现80%-85%的患者存在TSC1或TSC2突变,仅15%-20%临床确诊TSC的患者,检测不到TSC突变[13]。在我们的研究中,通过对此家系中先证者及其亲属进行TSC1及TSC2检测,发现先证者TSC2存在c.1880A>C杂合错义改变以及c.3883+3A>G可疑剪接改变,前者导致第627号氨基酸由His变为Pro(p.His627Pro),为国际上未见报道的新突变。先证者之胞弟(Ⅲ:6)、之母(Ⅱ:4)、之女(Ⅳ:1)及之外祖父(Ⅰ:1)均发现TSC2相同位点变异,其余家族成员(Ⅰ:2,Ⅱ:1,Ⅱ:3,Ⅱ:5,Ⅲ:5)上述两位点为野生型。通过对此突变位点在物种中的保守性进行分析,发现该位点参与组成的氨基酸在人类、小鼠、恒河猴中高度保守,因此我们认为c.1880A>C(p.His627Pro)突变可能是该家系患者致病的原因。c.3883+3A>G在人类、小鼠、恒河猴中高度保守,在人群中发生频率极低,用软件预测为多态,由于其未发生在经典剪接突变的位置,可能为该家系范围内遗传的单核苷酸多态变化,致病意义不明,需后期采集患者血液进行mRNA验证或者进行体外功能实验。因此,通过基因检测结果先证者之母、之女及之外祖父均可基因确诊为TSC。

虽然TSC为常染色体显性遗传病,但其自发突变率为65%-75%,2/3患者为散发病例[14]。在临床上,90%的TSC患者存在TSC2变异,多数具有TSC2突变的患者其临床表现较TSC1突变患者重[15]。进一步分析此家系成员的临床表型及基因型,发现先证者、其胞弟(Ⅲ:6)、其母(Ⅱ:4)、其女(Ⅳ:1)及其外祖父(Ⅰ:1)均存在相同的TSC2突变位点,但他们的临床表型存在异质性,先证者及其胞弟(Ⅲ:4及Ⅲ:6)临床表现较重,先证者之母(Ⅱ:4)及之女(Ⅳ:1)的临床表型较轻,先证者之外祖父(Ⅰ:1)否认明确的临床表现。2005年,Rok等[16]通过对100例TSC患者进行基因检测,发现4例患者(年龄分别为1.5,9,9,10岁)具有相同的TSC2 5238-5255del 18 bp,del 1746 HIKRLR,但他们的临床表型不同:4例患者均存在癫痫、色素脱失斑、脑室旁钙化和皮质结节,3例患者存在心脏横纹肌瘤和肾脏血管平滑肌脂肪瘤,2例患者存在智力落后和额面部纤维瘤。可见相同表型的TSC1或TSC2突变患者可能具有不同的临床表现。这可能与以下原因有关:第一,可能与年龄相关,TSC患者随着年龄增长,可能会出现多种临床表现,且一个患者可能并不能表现出TSC的所有临床表现[17,18]。第二,这种现象可用Knudson的二次打击学说进行解释,在经历第二次打击时,不同的器官以及在不同的生长发育时期均会出现体细胞突变,进而产生不同的临床表型[19]。第三,有文献报道[19],由于在肿瘤生成过程中有多种因素参与,因此TSC1和TSC2体细胞突变导致野生型等位基因缺失并不是某些肿瘤生成的唯一原因。这些不明确的机制可能也是造成相同基因型患者临床表型不同的原因。第四,由于表观遗传的影响,相同基因型的患者其临床表型也可能不同。因此,对于基因型相同的TSC患者,其临床表型异质性可能与多种因素相关。鉴于此,在我们研究的此家系中,具有相同基因型的TSC患者年龄不同,可能会出现多种临床表现,且Knudson二次打击学说、TSC1和TSC2体细胞突变导致野生型等位基因缺失以及表观遗传影响等均可能是造成此家系中相同基因型TSC患者临床表型不同的原因。

综上所述,本研究阐明了一个TSC家系表型异质性特征。先证者TSC2 c.1880A>C(p.His627Pro)为新生致病性突变,c.3883+3A>G可能为新生致病性突变,扩展了TSC2的突变谱。同时,本研究结果为此家系准确的遗传咨询和进一步的产前诊断提供了依据。

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