贝那普利对肝纤维化大鼠肝组织NOX4及AngⅡ表达的影响

郭 芳,申凤俊,吴龙龙,高 阳

(山西医科大学第一医院消化内科,太原 030001;*通讯作者,E-mail:sfj919016603@126.com)

肝纤维化是由各种病因引起的慢性反复肝损伤后的反应，其表现为肝脏细胞外基质(ECM)的弥漫性过度沉积。研究表明，肝内存在完整的局部肾素-血管紧张素系统(RAS系统)，血管紧张素转换酶(ACE)-AngⅡ-血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)轴是RAS系统的经典轴，而AngⅡ是经典轴中的主要效应因子，它能有效刺激肝星状细胞(HSC)使之增殖与活化，并释放出炎症因子和促纤维化因子，进一步促进了肝纤维化[1,2]。局部AngⅡ对肝损伤的研究发现, AngⅡ通过激活活性氧簇(ROS)增加肝损伤，而加用ACE抑制剂后可以减低肝损伤的程度[3]。近年的研究发现，由NOX产生的活性氧簇(ROS)介导的氧化应激反应与肝纤维化的发生关系密切，其中，NOX家族之一的NOX4被发现在活化的肝星状细胞(HSC)中表达更为丰富，并且可通过介导多条细胞信号通路参与了肝纤维化的形成[4]。此外有研究发现，AngⅡ的促纤维化效应需要NADPH氧化酶及其产生的ROS来实现[5]。因此，本实验通过CCl4建立肝纤维化大鼠模型，观察贝那普利对肝纤维化大鼠中NOX4及AngⅡ表达的影响，进一步探讨其抗纤维化机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

22只6周龄雄性SD大鼠，清洁级，体质量180-210 g，购于山西医科大学实验动物中心，生产许可证：scxk(晋)2012-0001。AngⅡELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司，随机引物、dNTP、逆转录酶、RNA酶抑制剂购自上海生工生物科技有限公司；贝那普利由北京诺华制药有限公司提供。

1.2 模型建立及标本制备

将22只大鼠随机分为正常对照组6只,模型组8只,贝那普利治疗组8只。除对照组外,余两组均给予皮下注射40%CCl4油剂,2次/周,首次5 ml/kg,以后每次2 ml/kg,对照组给予相同剂量的油剂皮下注射。预防治疗组从实验第1天开始给予贝那普利(10 mg/kg)灌胃,余两组给予相同剂量生理盐水灌胃,直至实验结束。三组大鼠均给予正常饮食。在第8周时,正常对照组、模型组和预防治疗组分别杀死大鼠6只,留取同一部位肝组织备用。

1.3 组织病理检查

对肝组织行常规HE染色及Masson三色染色,观察各组肝组织病理改变及纤维化程度。

1.4 AngⅡ测定

采用酶联免疫试剂盒双抗体夹心ABC-ELISA法测定肝匀浆AngⅡ浓度。

1.5 RT-PCR检测NOX4mRNA表达

采用Trizol试剂一步法抽提肝组织中总RNA,微量分光光度计检测RNA样品纯度。然后按照Fermentas K1622反应体系进行逆转录以及RT-PCR反应体系及条件按试剂盒说明书进行。

以β-actin 作为内参照基因,上游:5′-GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′,下游:5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT-3′,长度为141 bp;NOX4上游:5′-CGGGTGGCTTGTTGAAGTAT-3′,下游:5′-AAAACCCTCCAGGCAAAGAT-3′,长度为147 bp。

结果判定:ΔCt=Ct-Ctβ-actin。用各实验组样本的ΔCt减去正常对照组样本的ΔCt,得到ΔΔCt,以 2-ΔΔCt表示mRNA的相对表达量。

1.6 统计学分析

以上数据表示为均数±标准差,应用SPSS17.0统计软件进行分析,计量资料组间比较采用单因素方差分析;相关性分析采用Spearman相关分析法,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理表现

观察肝组织HE染色与Masson三色染色切片,正常对照组肝小叶的结构正常,肝细胞索排列规则。模型组可见部分肝小叶结构的消失,纤维间隔包绕形成了假小叶。治疗组大鼠肝组织的纤维化程度与模型组相比,有所减轻(见图1)。

2.2 贝那普利对肝纤维化大鼠肝匀浆AngⅡ的影响

模型组、预防治疗组与对照组肝匀浆AngⅡ表达量差异具有统计学意义(P<0.05)；并且预防治疗组与模型组中的肝匀浆AngⅡ表达量差异亦有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.3 贝那普利对肝纤维化大鼠肝组织NOX4 mRNA表达的影响

模型组及预防治疗组与对照组比较,NOX4表达差异具有统计学意义(P<0.05);并且模型组和预防治疗组NOX4表达差异亦有统计学意义(P<0.05,见表1)。

2.4 相关性分析

将肝匀浆AngⅡ与肝组织NOX4 mRNA的表达进行Spearman相关性分析，显示肝匀浆AngⅡ浓度与肝组织NOX4 mRNA表达变化存在显著正相关(相关系数r=0.472，P<0.05)。

3 讨论

肝纤维化是由各种致病因子致使肝脏细胞外基质(ECM)的过度沉积。如未能及时的治疗,最终进展为肝硬化甚至肝癌危害人类的健康。既往有研究表明,肝纤维化是肝硬化的早期阶段并且是必经阶段,亦是唯一可被逆转的阶段[6]。因此我们通过本实验研究贝那普利的抗肝纤维化作用及其相关机制具有重要的临床意义。

A.对照组HE; B.模型组HE;C.治疗组HE;D.对照组Masson;E.模型组Masson;F.治疗组Masson图1 对照组、模型组及治疗组肝组织病理表现Figure 1 Histopathological changes of liver in control group, model group and treatment group

分组 nNOX4AngⅡ(ng/ml)正常对照组62．03±0．3123．330±1．606模型组631．78±3．96∗48．625±1．357∗贝那普利治疗组615．93±5．01∗#45．518±3．072∗#

与对照组相比,*P<0.05,与模型组相比,#P<0.05

研究表明，肝脏中存在独立的RAS系统，其经典轴为ACE-AngⅡ-AT1轴，并且发现AngⅡ是经典轴中的主要多肽，其水平与肝纤维化的程度呈正相关[7]。在肝组织及肝细胞受到刺激或者损伤时，RAS系统就会被激活，其主要的效应物质AngⅡ通过与AT1结合后刺激各种细胞因子、炎症因子的释放以及HSC活化，促进了EMC的合成,打破了以往EMC合成与降解的平衡，从而促进了肝纤维化的形成。而作为一种血管紧张素转化酶抑制剂，贝那普利已被证实具有良好的抗纤维化作用[8,9]，其抗纤维化作用可能是通过抑制AngⅡ的产生进而减弱ACE-AngⅡ-AT1轴的激活。本实验结果显示：与对照组比较，模型组肝匀浆AngⅡ升高(P<0.05)；而给予贝那普利预防治疗后，肝匀浆AngⅡ表达量较模型组有所下降(P<0.05)，并且肝组纤维化程度也明显减轻。这与先前的研究结果是一致的。而最近的研究发现，AngⅡ不仅通过ATIR受体导致促纤维化因子的产生，它还可能通过作用于NOX产生ROS诱导氧化应激反应而促进肝纤维化的进展[5]。

NOX是一种多亚基的跨膜酶复合体, 目前已发现包括肝脏、肾脏、心脏等组织中存在表达。NOX家族由NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5及两个双重氧化酶Duox1和Doux2组成[10]。近年来的研究证实，NOX通过产生活性氧簇(ROS)介导的氧化应激反应与肝纤维关系密切。值得一提的是，肝细胞内NOX4的表达远远高于其他NOX亚型，并且是产生ROS的主要的亚型[11,12]。Bettaieb等[13]研究发现，在非酒精性脂肪肝炎(NASH)病人及饮食诱导的脂肪性肝炎小鼠中NOX4表达增多,给予其NOX4抑制剂后明显减轻了肝炎、肝纤维化的程度。此外，Jiang等[14]研究发现NOX4是一个重要的促纤维化因子，可激活TGF-β/Smad通路，使Smad3磷酸化介导了HSC的活化，并且NOX4在死亡配体诱导的肝细胞凋亡中也起着重要的作用。并且我们前期研究也证实：随着肝纤维化的形成，大鼠肝组织中NOX4的表达升高[9]。既往很多研究已发现贝那普利具有良好的抗纤维化作用，那么贝那普利能否通过抑制AngⅡ并进一步抑制NOX4介导的氧化应激反应而减轻肝纤维化程度，这方面研究报道甚少。本实验结果发现与对照组相比，模型组肝组织中NOX4表达升高(P<0.05)；在给予贝那普利进行干预后，肝组织中NOX4表达下降(P<0.05)。进一步进行相关性分析发现，AngⅡ与肝组织中NOX4 mRNA表达变化存在正相关性(r=0.472，P<0.05)。以上结论不仅证实了贝那普利的抗肝纤维化作用，并且表明其抗纤维化作用可能是通过抑制AngⅡ的表达进一步抑制NOX4介导的氧化应激反应来实现的。因此，进一步研究NOX4介导的氧化应激与肝纤维化的关系有望为肝纤维化的治疗策略提供一些新思路。

参考文献：

[1] Lotfy M,El-Kenawy Ael-M,Abdel-Aziz MM,etal.Elevated renin levels in patients with liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma[J].Asian Pac J Cancer Prev,2010,11(5):1263-1266.

[2] Wamer FJ, Lube JS,McCaughan GW,etal. Liver fibrosis:a balance of ACEs? [J]. Clin Sci (Lond), 2007, 113(3):109-118.

[3] Taskin E,Guven C,Sahin L,etal.The cooperative effect of local Angiotensin-Ⅱ in liver with adriamycin hepatotoxicity on mitochondria[J].Med Sci Monit,2016,22:1013-1021.

[4] Lan T, Kisseleva T, Brenner DA. Deficiency of NOX1 or NOX4 prevents liver inflammation and fibrosis in mice through inhibition of hepatic stellate cell activation [J]. PLoS One, 2015, 10(7):e0129743.

[5] Bataller R,Schwabe RF,Choi YH,etal. NADPH oxidase signal transduces angiotensin Ⅱ in hepatic stellate cells and is critical in hepatic fibrosis[J].J Clin Invest,2003,112(9):1383-1394.

[6] Arteel GE.Hope for the liver: Mechanistic insight into the role of the rennin angiotensin system in hepatic fibrosis[J].Hepatology,2004,40(1):263-265.

[7] Engeli S, Negrel R, Sharma AM. Physiology and pathophysiology of the adipose tissue renin-angiotensin system[J]. Hypertension, 2000, 35(6):1270-1277.

[8] 王丽华,申凤俊,许小妹. 血管紧张素Ⅱ及贝那普利对肝星状细胞ACE2和Ang-(1-7)/Mas受体的影响[J].山西医科大学学报,2015,46(11):1053-1056.

[9] 吴龙龙, 申凤俊, 王丽华. 肝纤维化形成过程中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4与血管紧张素Ⅱ/血管紧张素-(1-7)比值的动态变化[J]. 中华临床医师杂志:电子版,2016, 10(23):3564-3567.

[10] Barnes JL, Gorin Y. Myofibroblast differentiation during fibrosis: role of NAD(P)H oxidases[J].Kidney Int,2011,79(9):944-956.

[11] Sancho P, Mainez J, Crosas-Molist E,etal. NADPH oxidase 4 mediates stellate cell activation and hepatocyte cell death during liver fibrosis development[J]. PLoS One, 2012, 7(9):e45285.

[12] Ikeda R, Ishhii K, Hoshikawa Y,etal. Reactive oxygen species and NADPH oxidase 4 induced by transforming growth factor betal are the therapeutic targets of polyenylphosphatidylcholine in the suppression of human hepatic stellate cell activation[J]. Inflamm Res, 2011, 60(6):597-604.

[13] Bettaieb A, Jiang JX, Sasaki Y,etal. Hepatocyte NADPH oxidase 4 regulates stress signaling, fibrosis, and insulin sensitivity during development of steatohepatitis in mice[J]. Gastroenterology, 2015, 149(2):468-480.

[14] Jiang JX, Chen X, Serizawa N,etal. Liver fibrosis and hepatocyte apoptosis are attenuated by GKT137831, a novel NOX4/NOX1 inhibitor in vivo[J]. Free Radic Biol Med, 2012, 53(2):289-296.