甲硝唑对阴道乳杆菌增殖影响的体外研究

张 瑞,吴文湘,桑佳特

(1北京大学第一医院妇产科,北京 100034;2天津医科大学总医院妇产科;*通讯作者,E-mail:zuniverse@163.com)

阴道乳杆菌是健康育龄期女性阴道微环境中的优势菌群,对阴道微生态平衡的调控起主导作用。阴道微环境中乳杆菌数量的减少、缺失或者功能异常均可能导致阴道微生态平衡失调,诱发阴道疾病乃至女性全身性疾病。因此,在临床诊治过程中应该注意保护阴道乳杆菌。甲硝唑具有抗厌氧菌增殖的作用,在临床治疗中被用于预防和治疗厌氧菌感染。阴道乳杆菌属于兼性厌氧菌,在厌氧环境中更易生长繁殖。临床治疗中使用甲硝唑治疗后是否会抑制或杀灭阴道乳杆菌,近而对阴道微环境产生破坏作用,以往研究并未阐明。本研究通过体外研究的方法,系统评价甲硝唑对阴道来源的乳杆菌增殖的影响,以期为临床更科学使用甲硝唑提供全新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究人群

选取2016-03～2016-06在北京大学第一医院体检中心健康体检的18-45岁女性40例,排除因各种原因正在接受抗生素等药物治疗者3例、阴道微生态检测发现假丝酵母菌病5例、滴虫性阴道炎2例、细菌性阴道病7例,另有3例不愿参加本研究。最终选择符合试验要求的志愿者20例,经知情同意后纳入本研究。纳入标准:为无自觉症状的非妊娠健康女性。排除标准:1周内因任何原因阴道用药者;2周内有外阴及阴道不适者;1月内因任何原因用过抗生素或抗真菌药者;性伴侣近期被诊断过患性传播疾病者(支原体、衣原体、淋病、梅毒);妇科检查发现阳性体征者。入组时,每例患者取阴道分泌物两份。

1.2 阴道乳杆菌的分离纯化及鉴定

1.2.1 乳杆菌分离、纯化 ①无菌棉拭子在阴道侧壁中1/3段取分泌物,将棉拭子上的分泌物涮入MRS液体培养基,盖紧盖子,用封口膜密封,37 ℃,150 r/min摇菌过夜;②将过夜的菌液稀释,用麦氏比浊仪调整菌液浓度至0.5麦氏浊度(McFarland,MCF);③取0.5 MCF的菌液100 μl,均匀涂在MRS固体培养板,37 ℃,厌氧培养24-48 h;④从培养板上挑取单菌落,涂在新的MRS固体培养板上,37 ℃,厌氧培养48 h;⑤每个培养板上为一个纯的菌株,从培养板的菌落上挑取少量细菌,加入MRS液体培养基中,37 ℃,150 r/min摇菌过夜,菌液备用。

1.2.2 乳杆菌鉴定 本研究中采用菌落PCR扩增所有菌株的16srDNA基因全长,以纯化的菌落作为模版,采用细菌通用引物:上游引物5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′,下游引物5′-TACGYTACCTTGTTACGACT-3′。反应条件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,35个循环。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,切胶纯化后送上海生工生物有限公司测序。

1.2.3 甲硝唑对乳杆菌增殖的影响 将甲硝唑粉(Sigma-Aldrich)溶于MRS液体培养基中,使MRS溶液中甲硝唑浓度为0,128,256,512,1 024,2 000 μg/ml。向每管MRS液体培养基中加入0.5 MCF的乳杆菌菌液100 μl,盖紧盖子,密封管口,37 ℃,150 r/min摇菌;每3 h将离心管摇匀后,测其中菌液浓度1 次(采用菌液浊度表示),共检测24 h。每一种菌的6个药物浓度均同期做3个重复。

1.3 统计分析

每个时间点的菌液浓度采用浊度记录为均数±标准差,检测结果采用重复测量方差分析,根据分组因素、时间因素以及两个因素的交互效应情况分析药物对菌种增殖的抑制程度,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标本收集情况

共有20例无症状、无体征的健康女性纳入本研究。20位女性年龄27-40岁(平均年龄34岁),取材时间在卵泡期的13份,黄体期的7份。

2.2 菌株分离及鉴定

从20份标本共分离出54株乳杆菌,分属于乳杆菌的6个菌种:卷曲乳杆菌27株,加氏乳杆菌9株,詹氏乳杆菌8株,阴道乳杆菌6株,发酵乳杆菌和德氏乳杆菌各2株。

2.3 甲硝唑对乳杆菌增殖的影响

在MRS液体培养基中加入不同浓度甲硝唑,培养一定时间测菌液浊度,6种乳杆菌增殖时间与分组的交互效应、时间因素主效应和分组因素主效应均有明显差异(P<0.05,见图1-6)。

时间与分组的交互效应、时间因素主效应和分组因素主效应均有明显差异(P<0.05);128 μg/ml和256 μg/ml与对照组无明显差异(P>0.05)；512,1 024,2 000 μg/ml与对照组有明显差异(P<0.05)图1 卷曲乳杆菌增殖曲线Figure 1 Growth curve of Lactobacillus crispatus

时间与分组的交互效应、时间因素主效应和分组因素主效应均有明显差异(P<0.05);128 μg/ml与对照组无明显差异(P>0.05);256,512,1 024,2 000 μg/ml与对照组有明显差异(P<0.05)图2 加氏乳杆菌增殖曲线Figure 2 Growth curve of Lactobacillus gasseri

甲硝唑对乳杆菌增殖的影响与药物的浓度有关:当甲硝唑浓度为128 μg/ml时,对6种乳杆菌的增殖没有影响;当甲硝唑浓度≥512 μg/ml时,对6个乳杆菌的增殖产生明显的抑制作用;当甲硝唑浓度在128-512 μg/ml之间时,对卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌和发酵乳杆菌无明显效果,而对德氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和阴道乳杆菌产生明显的抑制作用。

时间与分组的交互效应、时间因素主效应和分组因素主效应均有明显差异(P<0.05);128 μg/ml与对照组无明显差异(P>0.05);256,512,1 024 μg/ml和2 000 μg/ml与对照组有明显差异(P<0.05)图3 德氏乳杆菌增殖曲线Figure 3 Growth curve of Lactobacillus delbrueckiii

时间与分组的交互效应、时间因素主效应和分组因素主效应均有明显差异(P<0.05);128 μg/ml与对照组无明显差异(P>0.05);256,512,1 024,2 000 μg/ml与对照组有明显差异(P<0.05)图4 詹氏乳杆菌增殖曲线Figure 4 Growth curve of Lactobacillus jenseniii

时间与分组的交互效应、时间因素主效应和分组因素主效应均有明显差异(P<0.05);128 μg/ml与对照组无明显差异(P>0.05);256,512,1 024,2 000 μg/ml与对照组有明显差异(P<0.05)图5 阴道乳杆菌增殖曲线Figure 5 Growth curve of Lactobacillus vaginalisi

时间与分组的交互效应、时间因素主效应和分组因素主效应均有明显差异(P<0.05);5个浓度分别与对照组比较均有明显差异(P<0.05)图6 发酵乳杆菌增殖曲线Figure 6 Growth curve of Lactobacillus fenmentumi

3 讨论

抗生素是20世纪最伟大的创举之一,抗生素自出现至今,其发展取得了举世瞩目的成绩。然而伴随抗生素发展的是传染病的增多。如抗生素曾经让结核病在全球销声匿迹,而据WHO最新的报告[1]:目前全球约有1 300万结核病病人,每年新增加结核病病例960多万,死亡150万。以超级细菌为代表的多重耐药菌株频繁出现,使越来越多的临床治疗陷入困境。面对越来越多的耐药菌株的出现、各种传染性疾病卷土重来、抗生素逐步无效化的局面,医学迫切需要一种全新的理念或方法来打破抗生素引起的这一怪圈。

既往对于疾病的治疗尤其是感染性疾病的治疗,着眼于杀灭致病源,较少考虑对机体益生菌的保护和微生态平衡的保护。临床治疗中出现的继发真菌感染或二次感染屡见不鲜。而感染微生态学认为:感染性疾病的治疗,应重在恢复和重建微环境平衡。据此,我们认为:评价临床常用药物对阴道乳杆菌的作用很重要。如果能让这些药在发挥治疗作用的同时,不至于破坏微生态环境中的益生菌、或者将其破坏作用降到最低,或者有的药物能对益生菌的增殖产生促进作用,将能给患者带来更多好处。

甲硝唑是临床治疗细菌性阴道病和滴虫性阴道炎的首选用药,能有效对抗阴道中多种专性厌氧菌、滴虫和一些兼性厌氧菌如幽门螺杆菌、阴道加德纳菌[2]。但对阴道乳杆菌的作用研究较少。本研究中发现,当甲硝唑浓度大于512 μg/ml时,对6种乳杆菌均产生抑制作用。既往有研究表明:阴道使用5 g甲硝唑凝胶(含37.5 mg甲硝唑)后,血药浓度为0.2 μg/ml[3],而阴道甲硝唑浓度可达到1 000 μg/ml[4]。Davis的研究发现:口服甲硝唑2 g,6 h后阴道甲硝唑浓度为26 μg/ml[5]。因此,与阴道使用甲硝唑相比,口服甲硝唑对阴道乳杆菌的破坏作用更小,提示在临床治疗中,在不影响治疗效果的前提下尽量口服甲硝唑的给药方式。Pendharkar等[4]研究发现健康女性阴道中分离出干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和詹氏乳杆菌,通过体外研究发现:高浓度的甲硝唑对乳杆菌产生一定程度的抑制作用,低浓度的甲硝唑对乳杆菌无作用,而中等浓度的甲硝唑对乳杆菌产生促进作用[4]。在本研究中,甲硝唑对6种阴道乳杆菌的影响亦与其浓度有关,但各种作用的临界药物浓度不同。另外,本研究中并未发现甲硝唑对乳杆菌的促增殖作用。造成上述差别的可能原因有:①本课题中的乳杆菌菌种与Pendharkar等[4]的研究中的菌种不同,不同菌种、甚至相同菌种的不同菌株之间的生物学特性并不完全相同,对阴道中的各菌种或菌株进行评价非常必要;②菌种来源于不同的人群。在不同人群中,人体遗传学差异、生活饮食特征及医疗卫生习惯存在差异,机体微生物经历的抗生素选择的压力不同、微生物传播耐药基因的状况不同[6],可能导致相同的菌种或菌株具有不同的药物敏感性。国外研究[7,8]发现:29%的阴道加德纳菌对甲硝唑具有耐药性。Nagaraja[9]研究发现:68%的阴道加德纳菌对甲硝唑具有耐药性。Beigi等[10]研究发现有些阴道厌氧菌对甲硝唑具有耐药性。因此,对不同国家和地区的人群中乳杆菌对药物敏感性分别研究非常重要。

参考文献：

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[10] Beigi RH, Meyn LA, Moore DM,etal. Vaginal yeast colonization in nonpregnant women: a longitudinal study[J]. Obstet Gynecol, 2004,104:926-930.