蒙药珍宝丸对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的神经保护作用△

包满节 阿古拉 斯其宫 刘 慧

(1.北京中医药大学 2014级博士研究生，北京 100029；2.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110；3.内蒙古医科大学2015级研究生，内蒙古 呼和浩特 010110；4.内蒙古医科大学附属人民医院病理科，内蒙古 呼和浩特 010020)

视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)是眼科常见的一种临床表现，是眼科临床中失明、致盲性疾病的主要病理过程。视网膜缺血再灌注损伤的病理生理过程较复杂，目前为止，其发生机制尚未得到彻底阐明，研究表明RIRI是由多种因素有关，如氧自由基损害、基因调控、钙超载、炎症反应、兴奋性氨基酸作用等等，最终结局为细胞凋亡。本研究采用急性高眼压法建立RIRI模型，探讨蒙药珍宝丸对视网膜形态学结构及神经节细胞凋亡的影响，为防治视网膜缺血再灌注损伤性疾病提供理论依据。

1 实验材料

1.1 药品与试剂 珍宝丸(Ⅰ号)(内药制字M1401081)由内蒙古国际蒙医医院国家蒙药制剂中心提供；复方托吡卡胺滴眼液(H20110093，参天制药(中国)有限公司)购于内蒙古医科大学附属医院药房；盐酸丙美卡因滴眼液(H20160133，S.A.ALCON-COUVREUR N.V.)，购于内蒙古国际蒙医医院药房；原花青素(葡萄籽提取物)批号：002-1503012-27，天津市尖峰天然产物研究开发有限公司；用0.9%生理盐水稀释配制成10%水合氯醛，天津市北联精细化学品开发有限公司提供。

TUNEL试剂盒：In situ cell death detection kit, POD，产品编号：11684817910，美国Roche公司；4%多聚甲醛液：由内蒙古医科大学附属人民医院病理科提供；无水乙醇：天津市北联精细化学品开发有限公司提供；伊红染液和苏木素染液：北京素莱宝科技有限公司提供。

1.2 动物 SD大鼠(280±20g)12只，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司动物中心提供[实验动物生产许可证：SCXK-(军)2012-0004]，动物一般状态良好，皮毛光滑，进食与活动均正常，外眼及眼底检查均正常。

1.3 仪器 包埋机：Leica EG1160 德国；切片机：H93/RM2126 德国；显微镜：尼康显微镜ECLIPSE LV100POL / 50IPOL 日本；图像采集系统 Image Pro-Plus 6.0。

2 方法

2.1 用药方法 随机选取SD大鼠(280±20g)，分正常组、模型组、蒙药组(珍宝丸)、中药组(原花青素)，共4组，每组保证3只以上大鼠。将珍宝丸用开水浸泡、捣碎做混悬液备用。蒙药组(0.54g/kg)和中药组(0.81g/kg)1次/d，连续灌胃7d后，末次给药6h后开始造模，次日处死大鼠。

2.2 大鼠模型的制作 选取各组大鼠称体重，用 10% 水合氯醛0．35m L /100g 腹腔内注射麻醉、固定，双眼进行造模，滴托吡卡胺滴眼液散瞳10min后滴盐酸丙美卡因滴眼液眼表面麻醉，将连有无菌0．9%氯化钠溶液输液瓶的小儿头皮针刺入大鼠眼前房，输液瓶缓慢升高至150cm高度时大鼠眼内即形成110mmHg，造成视网膜缺血，1h 之后又缓慢降低输液瓶高度，降低眼压，虹膜及球结膜颜色迅速恢复正常，大鼠视网膜呈橘红色，说明缺血再灌注损伤模型成功建立。

2.3 组织取材 再灌注24h后用10%水合氯醛深度麻醉大鼠致死后，迅速摘取双侧眼球，切除眼前节，放入4%多聚甲醛液中固定，冲洗后常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，平行于视神经矢状轴连续切片，厚度为4μm。进行HE染色和TUNEL检测并观察视网膜病理学变化和细胞凋亡。

2.4 HE染色 石蜡切片脱蜡至水，苏木素液染色6min，双蒸馏水冲洗两次，1%盐酸酒精分化，自来水冲洗，梯度酒精脱水；伊红染色，体积分数95%酒精分色；无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

2.5 TUNEL检测 使用美国Roche公司生产的TUNEL试剂盒进行检测细胞凋亡，显微镜下见细胞凋亡位于细胞核，呈黄色或棕褐色。每眼每张免疫组化切片于200倍视野拍3张区域不同视野照片，应用Image pro-Plus 6.0图像分析系统进行总细胞数和阳性细胞数，取平均值为该眼阳性细胞数。凋亡细胞数/总细胞数×100%记为凋亡指数(apoptosis index ,AI)。

2.6 统计学方法 采用SPPS20.0软件进行统计分析。数据经正态性检验和方差齐性检验后，符合正态分布且方差齐的数据，组间进行单因素方差分析并进行两两比较，结果以(±s)表示，不符合则采用多个独立样本的非参数检验，用中位数(p25，p75)表示。

3 结果

3.1 HE染色结果 HE染色显示正常组大鼠视网膜结构清晰，各层细胞排列紧密(ZC♀400倍)；模型组大鼠缺血再灌注损伤24h后视网膜细胞形态不规则，视网膜全层水肿，细胞排列明显疏松、紊乱，细胞数量减少(MX♀400倍)；蒙药组和中药组，缺血再灌注损伤后24h，视网膜全层水肿，程度较模型组减轻，各层细胞形态较规则，细胞排列疏松、紊乱、比模型组较规整，视网膜较厚(MZ♀400倍、ZY♀400倍)。结果如图1

3.2 TUNEL染色 阳性细胞为黄色或棕褐色，分布于细胞核，阳性细胞主要位于神经节细胞层。正常大鼠视网膜未见凋亡细胞(400倍); 模型组再灌注24h后，即可见视网膜神经节细胞凋亡明显,与正常组相比，模型组凋亡细胞阳性率升高，差异有统计学意义P=0.004(400倍)；治疗组再灌注24h后，与模型组相比，蒙药组凋亡细胞阳性率降低，差异有统计学意义P=0.01(400倍)；与模型组相比，蒙药组凋亡细胞阳性率降低，差异有统计学意义P=0.02(400倍)；治疗组间无统计学意义，结果见表1和图2。

表1 各组凋亡细胞阳性率比较 (P25,P75)

注：a：与正常组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；b:与蒙药组比较，差异有统计学意义(P<0.05)

4 讨论

细胞凋亡这一概念于1972年首次由英国病理学家Kerr[1]等提出，随之国内外越来越多的学者开始致力于细胞凋亡的深刻研究中。细胞凋亡(apoptosis)又称为细胞程序性死亡，可引起形态学和生物化学的改变，发生在细胞，可导致其死亡[2]。研究证实，细胞凋亡是视网膜缺血再灌注损伤中神经细胞死亡的主要形式。本实验运用高眼压模型引起视网膜缺血再灌注24h后，用TUNEL检测方法检测凋亡细胞，可以观察到神经节细胞层细胞核呈黄色或棕褐色，表明神经节细胞层细胞计数减少，证实神经节细胞因凋亡而减少。故此，本实验高眼压引起视网膜缺血再灌注损伤模型建立成功。

珍宝丸又名额尔敦-乌日勒，由珍珠、麝香、牛黄等29味天然药物组合而成的其功能和疗效犹如珍宝故此命名为珍宝丸。主治黑白脉病、萨病、痛风、风湿、麻风病、黄水病、肾热、肾脉震伤、陈热扩散于脉道筋脉抽搐、关节屈曲挛缩等症[3]。现代药理实验证实：本方具有扩张毛细血管、改善微循环、降低血液黏度、改善血液流变性、抑制血小板凝聚、抗血栓、恢复神经损伤、清除氧自由基等作用[3]。此外，研究表明珍宝丸对家兔和大鼠高眼压引起视网膜缺血再灌注损伤具有保护作用[4-6]。

我们在大鼠RIRI模型中运用病理切片和TUNEL检测方法检测了视网膜形态学结构及神经节细胞凋亡情况，发现大鼠视网膜缺血再灌注24h后视网膜细胞形态不规则，排列紊乱，视网膜变薄。细胞凋亡明显，凋亡细胞为黄色或棕褐色，分布于细胞核。珍宝丸治疗组的视网膜各层细胞形态较规则，排列整齐，细胞凋亡明显降低与中药组基本一致。因此，珍宝丸能够抑制其细胞凋亡的发生，可以明显减轻组织损伤，对视网膜神经细胞具有保护作用，其机制有待于进一步研究。

[1]J F R Kerr, A H Wyllie, A R Currie. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wideranging Implications in Tissue Kinetics[J]. British journal of cancer, 1972, 26(4):239.

[2]Marek.The role of the apoptosome in the activation of procaspase-9.[J]. Post py Higieny I Medycyny Do wiadczalnej, 2013, 67(863688):54.

[3]蒙古学百科全书编辑委员会.蒙古学百科全书·医学[M].呼和浩特：内蒙古人民出版社，2012；(汉语版)：225-226.

[4]李常胜, 塔娜, 彻伊如格勒图,等. 蒙药额尔顿·乌日勒对视网膜缺血再灌注损伤大鼠血清中NO 和NOS的影响[J]. 内蒙古医科大学学报, 2016, 38(6):568-571.

[5]吴萨日娜, 乌仁图雅. 蒙药珍宝丸对视网膜缺血再灌注损伤Fas/Fasl、P53蛋白表达的影响及意义[J]. 世界科学技术:中医药现代化, 2011, 13(5):888-893.

[6]敖其尔, 乌仁图雅. 蒙药珍宝丸对视网膜缺血再灌注损伤中的影响及ICAM-1,Caspase-3的表达[J]. 中国民族医药杂志, 2016, 22(10):59-61.