UPLC法测定维药罗补甫克比日丸的西红花药材和制剂中西红花苷的含量△

庞克坚 翟 欣 唐 辉* 罗 兰 王亚乔

(1.和田维吾尔药业股份有限公司，新疆 和田 848200； 2.石河子大学药学院，新疆特种植物药资源教育部重点实验室，新疆 石河子 832002)

西红花苷是名贵中药西红花的有效成分，具有抗血小板聚集，保护血管内皮细胞，改善心肌缺血，调血脂等多种作用[1-7]，其中2个主要成分西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ亦是目前西红花质量控制的指标成分。

罗补甫克比日丸是新疆维吾尔族特色药之一，主要由丁香、西红花、花椒、胡萝卜子、肉桂、韭菜子等30 味药材组成，具有温补脑肾、益心填精的功效，主要用于阳痿、抑郁、早泄、滑精、体虚、消瘦、神经衰弱的治疗，属部颁标准维吾尔药分册收录品种[8]。部颁标准仅采用理化鉴别试验来控制该制剂的质量，并未对贵细药材西红花进行质量控制。制剂中西红花的质量与药品疗效密切相关，应予以关注。为进一步完善罗补甫克比日丸质量标准，本实验对罗补甫克比日丸的西红花药材和制剂中的西红花苷含量进行测定，对全面客观地评价罗补甫克比日丸药品质量提供科学依据。

1 仪器和试药

1.1 仪器 Waters Acquity超高效液相色谱仪(包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、PDA检测器、Empower 色谱工作站)，KH-300DE型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；十万分之一电子天平(BT125D，德国赛多利斯公司)。

1.2 试药 西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ(批号：111588-201303、111589-201304中国食品药品检定研究院)，西红花药材(201611)、罗补甫克比日丸(批号：20170204、20170301、20170302) 由和田维吾尔药业有限责任公司生产；乙腈为色谱纯；水为双蒸馏水；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ色谱条件 采用 Waters HSS-C18 (100mm×2.1mm，1.8μm) 色谱柱，流动相:以乙腈(A)-水溶液(B) 为流动相，梯度洗脱(0～5 min，20% →40% A；5～5.5min，40%→20%A，5.5～6min，20% →20% A)，流速0.2 mL/min，检测波长：440nm，柱温为35 ℃，对照品进样体积1μL，西红花药材及供试品进样体积5μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ对照品适量，分别加50%乙醇溶解，制成浓度分别为 0.543 mg/mL、0.603 mg/mL的对照品溶液。各取对照品溶液适量，加50%乙醇定容至5 mL容量瓶，制得西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ混合对照品浓度分别为54.30 μg/mL、60.30 μg/mL的混合对照品溶液。避光保存在4℃下备用。

2.2.2 西红花药材溶液的配制 取西红花药材约0.5 g，精密称定，加50%乙醇于25 mL容量瓶中，超声(功率500 W，频率50 kHz)30 min，放至室温，用50%乙醇补足至刻度，过滤，滤液经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3 供试品溶液的配制 取罗补甫克比日丸1.5 g，精密称定，加50%乙醇于25 mL容量瓶中，超声(功率500 W，频率50 kHz)30 min，放至室温，用50%乙醇补足至刻度，过滤，滤液经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 系统适用性试验 精密量取“2.2”项下对照品溶液、西红花药材溶液和供试品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度>1.5；理论板数以西红花苷-Ⅰ峰计不少于5000，西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ保留时间分别为 4.683、5.463 min 。结果表明，其他成分对测定无干扰。

2.4 西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ线性关系考察 取“2.2.1”项下的混合对照品在“2.1”项色谱条件下分别取0.3、0.6、1.2、2.4、4.8和7.5 μL进样测定。以峰面积 Y 为纵坐标，进样量X (μg)为横坐标进行线性回归，结果见表1。

表1 线性关系考察结果 (n=6)

2.5 西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ精密度试验 取同一混合对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，记录色谱峰面积，结果西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ峰面积的RSD分别为0.61%、0.54%，结果表明仪器精密度良好。

2.6 西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ重复性试验 取同一样品罗补甫克比日丸供试品溶液6份，每份1.5 g，精密称定，按“2.2.3”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件下进行分析，记录各色谱峰面积，结果西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ峰面积的RSD分别为1.6% 和0.99%，结果表明方法重复性良好。

2.7 西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ稳定性试验 将制备的罗补甫克比日丸供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h内进样6次，记录峰面积，结果西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ12 h内的峰面积的RSD分别为1.5和1.3%。

2.8 西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ加样回收率实验 取已测知西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ2种成分准确含量的罗补甫克比日丸9份，每份约0.5 g，精密称定，再分别精密加入相当于含量80%、100%、120%的西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ对照品溶液，按“2.2.3”项方法分别制备得到低、中、高不同浓度的供试溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率和RSD值，西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ平均加样回收率( n=9) 分别为99.90%和100.1%，RSD 分别为1.6%和1.3%。结果表明该方法的加样回收率良好。结果见表2。

表2 加样回收率实验结果(n=9)

3 含量测定

3.1 西红花药材含量测定 取西红花药材平行3份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行测定，计算罗补甫克比日丸中西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的含量，结果见表3。

由结果表明，西红花中西红花苷的总量符合标准要求[9](>10%)。

表3 西红花药材含量测定实验结果(mg/g n=3)

3.2 罗补甫克比日丸制剂含量测定 取3批样品，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进行测定，计算罗补甫克比日丸中西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的含量，结果见表4。

由结果表明，3份样品西红花苷含量相对较稳定。

表4 样品含量测定实验结果(μg/丸 n=3)

4 讨论

4.1 检测波长的选择 取西红花苷对照品储备液(0.543 mg/mL、0.603 mg/mL)适量，用50%乙醇溶解并稀释成18.10 μg/mL、20.10 μg/mL溶液，用紫外可见分光光度计于 200～600nm 处进行扫描，从其紫外图谱中可见其在440nm 处有最大吸收，与有关参考文献[10]报道的440 nm 一致，故选择440 nm 为检测波长。

4.2 提取溶剂的选择 分别比较甲醇、50% 甲醇、乙醇、50%乙醇的提取效率，结果显示50%乙醇提取效率最高，因此最终选择50%乙醇作为提取溶剂。

4.3 流动相的选择 在选择流动相时，我们首先参照2015版中国药典的色谱条件，甲醇-水(45:55)为流动相，但此条件下西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ出峰峰形不理想，分离度较差。在综合了有关文献报道[10-14]的基础上，经过多次摸索，最终拟定了乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，所得峰形良好，分离度高。

5 结论

通过测定西红花药材中西红花苷的含量，表明，企业在制剂生产中的药材质量是有保证的。测定的罗补甫克比日丸中西红花苷的含量也符合企业标准。

本实验所建立的超高效液相色谱分析方法与条件能较好地测定西红花和罗补甫克比日丸中西红花苷的含量。本实验方法精密度、重复性和稳定性良好，结果稳定可靠，并且采用的超高效液相色谱法相较高效液相色谱方法灵敏度高、分析时间短。能够为建立更加科学规范的罗补甫克比日丸质量评价和控制方法提供参考。

[1]马世平, 刘保林, 周素娣, 等. 西红花总苷的药理学研究Ⅱ对血凝、血小板聚集及血栓形成的影响[J]. 中草药, 1999, 3(3): 196.

[2]THUSHARARM, HEMSHEKHAR M, SANTHOSH MS, et al. Crocin, a dietary additive protects platelets from oxidative stress-induced apoptosis and inhibits platelet aggregation[J]. Mol Cell Biochem, 2013, 373(1-2): 77.

[3]何书英, 钱之玉. 西红花苷对氧化性低密度脂蛋白致内皮细胞损伤的保护作用[J]. 中国新药杂志, 2005, 14(2): 169.

[4]绪广林, 钱之玉. 西红花苷对血管内皮细胞的保护作用研究[J]. 中草药, 2002, 33(5): 439.

[5]杜鹏, 钱之玉, 沈祥春, 等. 西红花苷对大鼠心肌损伤的影响[J]. 中国新药杂志, 2005, 14(12): 1423.

[6]钱之玉. 西红花苷调血脂作用的实验和临床研究[J]. 中国执业药师, 2009, 6(2): 6.

[7]绪广林, 余书勤, 龚祝南, 等. 西红花苷对大鼠实验性高脂血症的影响及其机制研究[J].中国中药杂志, 2005, 30(5): 369.

[8]中国药典委员会. 中华人民共和国卫生部药品标准(维吾尔药分册)[M]. 乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社, 1998: 155.

[9]国家药典委员会.中国药典一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015:129-130.

[10]李顺旭, 杨大坚, 李荣东, 等. 高效液相色谱梯度洗脱法测定不同中国产西红花药材中西红花苷Ⅰ、Ⅱ的含量[J]. 中南药学,2010,(12): 886-889.

[11] 张留记, 刘钦松, 屠万倩, 等. RP-HPLC法同时测定不同产地栀子中栀子苷、西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量[J]. 中国药房, 2011, 3(07):630-632.

[12] 梁华正, 丁武辉, 袁东香, 等. 栀子中西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的高效液相色谱法测定[J]. 时珍国医国药, 2012, 5(10): 2386-2388.

[13] 马慧萍, 李兰茹, 董志臣, 等. HPLC法测定红花益气养血胶囊中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量[J]. 解放军药学学报, 2013, 7(06): 512-514.

[14] 李木子,王京辉,蔡程科,等. 栀子饮片质量分析研究[J]. 药物分析杂志,2014,(06):1025-1032.