硫辛酸合成酶在Leprdb/db小鼠肝肾中的表达

彭强，赵英政，闫婷婷，翟晓楠，张旭旭，易宪文，张合喜，徐光翠

(新乡医学院公共卫生学院，河南 新乡 453003)

肥胖和糖尿病严重威胁人类健康，2016年的一项研究显示我国肥胖人口数全球第一， 18岁及以上成年人中糖尿病患病率高达11.6%[1-2]。瘦素受体缺陷的Leprdb/db小鼠由于阻断了其瘦素信号通路，使食物摄入量增加，产热量下降，导致小鼠肥胖，其发病过程与人类的2型糖尿病的发生过程类似[3]。硫辛酸(lipoic acid)是一种强抗氧化剂，临床上已用于防治糖尿病周围神经病变。硫辛酸是在线粒体内由硫辛酸合成酶(lipoic acid synthase, LIAS)合成，其作用与硫辛酸合成酶的表达密切相关。目前关于瘦素和硫辛酸合成酶的作用关系还不清楚，Leprdb/db小鼠体内LIAS蛋白表达的研究尚未见报道。本实验通过检测Leprdb/db小鼠糖脂代谢相关指标及肝、肾中LIAS蛋白的表达，探讨阻断瘦素信号通路导致的小鼠糖脂代谢紊乱是否与LIAS蛋白的表达量相关，为明确硫辛酸在调控糖脂代谢中的作用机理，探索肥胖和糖尿病的防治新策略提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级Leprdb/+及Leprdb/db小鼠来自Jackson实验室(北卡罗来纳大学易宪文教授赠送)。动物饲养于SPF级动物房【SYXK(豫) 2014-0005】，自由摄食(上海斯莱康SPF级小鼠专用饲料)和饮水，室温20～25℃，相对湿度60%～70%，昼夜明暗交替时间12 h /12 h。所有动物实验操作将遵守新乡医学院实验动物伦理管理条例。

1.1.2 试剂和仪器

总胆固醇试剂盒(南京建成，中国，批号20170708)、甘油三脂试剂盒(南京建成，中国，批号20170708)、高密度脂蛋白试剂盒(南京建成，中国，批号20161229)、低密度脂蛋白试剂盒(南京建成，中国，批号20161228)、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒(南京建成，中国，批号20170719)、谷草转氨酶(AST)试剂盒(南京建成，中国，批号20170719)，磷酸酶抑制剂、RIPA裂解液、线粒体分离试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天，中国)，蛋白质marker (北京全式金，中国)，兔多抗LIAS抗体(Proteintech，美国)，兔多抗GAPDH抗体(杭州贤至，中国)；强生稳豪型血糖仪 (强生，美国)，低温离心机(Eppendorf，德国，5424R)，电泳仪(北京六一，中国，JY300C)，多功能酶标仪(Thermo，美国，EnSpireTM2300)。

1.2 方法

1.2.1 线粒体的制备

选取10周龄的Leprdb/+及Leprdb/db雄性小鼠各8只，即为Leprdb/+组和Leprdb/db组。禁食8 h后，测量两组小鼠体重，同时，采用强生稳豪型血糖仪测定小鼠空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)。经乙醚麻醉，腹主动脉采血后，处死动物，分离肝、肾并称重。取肝右叶及左肾组织于4%多聚甲醛固定，其余肝、肾组织-80℃保存。取200 mg肝、肾组织，用玻璃匀浆器于冰水浴中匀浆20次。用线粒体分离试剂盒采用差速离心法提取肝、肾组织线粒体。

1.2.2 肝肾组织病理学检查

组织固定24 h后，酒精梯度脱水，常规石蜡包埋，切片(4 μm)，苏木素-伊红(HE)染色，封片后光镜下观察两组肝、肾组织病理变化并拍照。

1.2.3 血清生化指标检测

分离血清，按试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪检测血清中总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)，谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)含量。

1.2.4 Western blot法检测肝、肾组织线粒体内LIAS蛋白的表达

取已制备的线粒体，加入200 μL临用前添加了苯甲基磺酰氟(PMSF)(终浓度为1 mmol/L)的线粒体裂解液。裂解后的蛋白样品采用BCA法进行蛋白定量。参照解现星等[4]的方法检测肝、肾组织线粒体内LIAS蛋白。蛋白变性后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。用电转膜仪转到PVDF膜上，用含5% 脱脂奶粉的封闭液(TBST)室温封闭2 h，按1∶2000加入LIAS抗体，按1∶1000加入GADPH抗体，4℃ 孵育过夜。TBST充分洗涤PVDF膜，按1∶8000的稀释倍数加入二抗，37℃孵育2 h，再次用TBST洗涤，用ECL显色并曝光，采用BandScan分析胶片灰度值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 Leprdb/+和Leprdb/db小鼠体重及其脏器系数比较

与Leprdb/+小鼠比较，Leprdb/db小鼠体重、肝重、肝器系数及肾重均明显升高，而肾器系数降低，差异有显著性(P<0.05)。见表1。

表1 Leprdb/+和Leprdb/db小鼠体重、肝肾重量及其脏器系数比较Tab.1 Comparison of body weight, liver, kidney weight and their organ coefficients in the Leprdb/+and Leprdb/dbmice(n=8,

注：*与Leprdb/+组比较，*P<0.05。

Note. Compared with theLeprdb/+mice,*P<0.05.

2.2 Leprdb/+和Leprdb/db小鼠肝肾组织病理学观察

由图1可见，对照组Leprdb/+小鼠肝、肾组织结构完整，无明显病理学改变；而Leprdb/db小鼠肝细胞出现脂肪变性，肾小球肥大，基地膜增厚，系膜区增宽，系膜细胞和系膜基质增多等病理学改变。

2.3 Leprdb/+和Leprdb/db小鼠生化指标的测定

表2可见，空腹血糖Leprdb/db小鼠明显高于Leprdb/+小鼠，两者相比较差异有显著性(P<0.01)；与Leprdb/+小鼠比较，Leprdb/db小鼠CHO、TG、LDL，ALT均明显升高差异有显著性(P<0.05)。

图1 Leprdb/+和Leprdb/db两组小鼠肝、肾细胞形态病理观察(HE染色,×100)Fig.1 Pathological observation of cellular morphology from liver and kidney tissues in the Leprdb/+and Leprdb/dbmice(HE staining, ×100)

动物组Animalgroups空腹血糖FPG(mmol/L)总胆固醇CHO(mmol/L)甘油三脂TG(mmol/L)高密度脂蛋白HDL(mmol/L)低密度脂蛋白LDL(mmol/L)谷草转氨酶AST(U/L)谷丙转氨酶ALT(U/L)Leprdb/+组5.63±1.612.56±0.540.70±0.193.36±0.420.21±0.0324.83±9.2912.66±4.39Leprdb/db组14.42±4.60**4.89±1.29*1.43±0.31*2.91±0.431.35±0.61*25.47±5.7750.20±16.52**

注：与Leprdb/+组比较，*P<0.05；与Leprdb/+组比较，**P<0.01。

Note.Compared with theLeprdb/+mice,*P<0.05. Compared with theLeprdb/+mice,**P<0.01.

2.4 Western blot 法检测Leprdb/+和Leprdb/db小鼠肝肾线粒体中LIAS蛋白表达

Western blot检测结果显示，Leprdb/db小鼠在肝肾线粒体中LIAS蛋白表达量均高于Leprdb/+小鼠，差异均有显著性(P<0.05)。见图2、3。

注：*与Leprdb/+组比较，*P<0.05。下图同。图2 Western blot法检测Leprdb/+和Leprdb/db小鼠肝线粒体中LIAS蛋白表达Note. compared with the Leprdb/+ mice. The same in the following FigFig. 2 Expressions of LIAS in mitochondria of Leprdb/+and Leprdb/db mouse liver tissues by western blot analysis

图3 Western blot 法检测Leprdb/+和Leprdb/db小鼠肾线粒体中LIAS蛋白表达Fig.3 Expressions of LIAS in mitochondria of Leprdb/+and Leprdb/db mouse renal tissues by western blot analysis

3 讨论

随着生活水平的提高，饮食过剩和运动不足使肥胖成为全球性流行病，而肥胖容易引起胰岛素抵抗，导致糖尿病[5]。糖尿病是以慢性高血糖为特征的一种代谢性疾病，其中2 型糖尿病占该病的95%，已成为严重威胁人类健康的常见慢性疾病，在全世界范围内的发病率呈现逐年增长趋势。对肥胖、糖尿病及其并发症的研究已成为生物医学研究的热点。

Leprdb/db小鼠是leptin受体基因缺陷导致先天肥胖并呈现2 型糖尿病特征的模型动物。该小鼠位于4 号染色体的瘦素受体基因发生突变，主要表现为下丘脑缺陷，对饱感物质(瘦素) 缺乏反应，具有高血糖、高胰岛素血症、糖代谢异常等特征，与人类2 型糖尿病临床症状极为相似，是研究人类2 型糖尿病良好的动物模型[6]。

实验动物脏器重量和脏器系数是鉴定动物遗传质量的重要依据，反应了模型动物的生物学特性及相应脏器的损害[7]。本研究结果显示，Leprdb/db小鼠体重、肝、肝器系数及肾重量明显大于Leprdb/+组小鼠，而肾器系数小于Leprdb/+组小鼠，与吕晶晶等[9]研究结果一致[8]。2型糖尿病动物模型会出现胰岛增生肥大的病理改变，糖尿病肾病是典型的糖尿病并发症，也是造成慢性肾功能衰竭的常见原因。本研究发现Leprdb/db小鼠血清AST明显升高。AST主要分布在肝细胞浆和肝细胞线粒体中，是反映肝损伤的一个重要指标，它的升高提示肝细胞损伤达到了细胞器水平。Leprdb/db小鼠出现了糖尿病发展过程中肝、肾的典型病理改变，镜下可见Leprdb/db小鼠肝细胞出现脂肪变性，肾小球肥大，基底膜增厚，系膜区增宽，包括系膜细胞和系膜基质增多等形态学改变。

血糖是评价糖尿病的重要指标，高血糖是由于对胰岛素作用的抵抗以及胰岛素分泌代偿不足造成的。2型糖尿病是一种机体对胰岛素抵抗而引起的病变，而胰岛素抵抗常引起脂质代谢异常。因为胰岛素有促进脂蛋白分解的作用，当胰岛素抵抗时，富含甘油三酯的脂蛋白在血中堆积，包括乳糜微粒、极低密度脂蛋白、中密度脂蛋白等，导致患者血液中的甘油三酯明显升高，同时，低密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇也会不同程度的升高。脂肪代谢紊乱对糖尿病及其并发症的发生有着重要的作用。本研究结果显示Leprdb/db小鼠空腹血糖明显高于Leprdb/+小鼠，Leprdb/db小鼠CHO、TG、LDL均明显升高，这与文献报道结果一致[8,10]。

硫辛酸是由线粒体中硫辛酸合成酶 (LIAS)产生的强抗氧化剂，可以清除体内多种自由基并能还原其他抗氧化剂，在体内抗氧化系统调控中发挥重要作用[11-13]。由于其在线粒体内生成，可通过抗氧化而发挥保护线粒体作用，同时参与能量代谢，是几种线粒体酶如丙酮酸脱氢酶复合酶的辅酶，因而硫辛酸合成酶对糖尿病及其慢性并发症发挥重要调控作用[14]。本研究利用Western blot法检测Leprdb/+和Leprdb/db小鼠肝肾线粒体中LIAS蛋白表达，发现Leprdb/db小鼠的肝肾线粒体中LIAS蛋白表达量均高于Leprdb/+小鼠，差异有显著性，表明LIAS蛋白在Leprdb/db小鼠和Leprdb/+小鼠中有着不同表达，其在瘦素受体缺陷导致的糖脂代谢紊乱中可能发挥调节作用。

综上，瘦素受体缺陷的Leprdb/db小鼠存在糖脂代谢紊乱，肝、肾细胞病理损伤；Leprdb/db小鼠肝、肾线粒体中LIAS蛋白表达明显高于Leprdb/+小鼠。提示对LIAS蛋白表达的调控有望成为防治肥胖和糖尿病的新策略。

参考文献(References)

[1] NCD Risk Factor Collaboration (NCD-RisC). Worldwide trends in diabetes since 1980: a pooled analysis of 751 population-based studies with 4.4 million participants [J]. Lancet (London, England), 2016, 387(10027): 1513-1530.

[2] Xu Y, Wang L, He J, et al. Prevalence and control of diabetes in Chinese adults [J]. JAMA, 2013, 310(9): 948-959.

[3] 刘芳，杨华，周文江，等．诱发性2型糖尿病小鼠模型与自发性db/db小鼠特性的比较 [J]．中国实验动物学报，2014，22(06): 54-59．

Liu F, Yang H, Zhou WJ, et al. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus [J]. Acta Lab Anim Sci Sin, 2014, 22(06): 54-59.

[4] 解现星，张涛，赵爽，等．苏子油对肥胖大鼠 肝脏极低密度脂蛋白 合成关键 基因 表达的 影响. 中国实验动物学报，2015，23(05)：474-478．

Xie XX, Zhang T, Zhao S, et al. Effect of perilla oil on the key gene expression regulating hepatic VLDL synthesis in obese rats [J]. Acta Lab Anim Sci Sin, 2015, 23(05): 474-478．

[5] 吴静，王华旻，李晶，等．db /db小鼠的实验室应用 [J]. 生理科学进展，2013，44(1): 12-18．

Wu J, Wang HM, Li J, et al. The research applications of db/db mouse [J]. Prog Physiol Sci, 2013, 44(1): 12-18.

[6] Portha B. Programmed disorders of beta-cell development and function as one cause for type 2 diabetes? The GK rat paradigm [J]. Diab Metab Res Rev, 2005, 21(6): 495-504.

[7] 田小芸，恽时锋，周森妹，等．C57BL/KsJ-db/db、+/db小鼠主要脏器重量及脏器系数的测定[J]. 中国比较医学杂志，2006，16(4): 220-222．

Tian XY, Yun SF, Zhou SM, et al. The weight of main organs and organ coefficient in db/db and +/db mice[J]. Chin J Comp Med, 2006, 16(4): 220-222.

[8] 吕晶晶，王彩霞，魏娜，等．自发性2 型糖尿病小鼠db /db的生物学特性 [J].沈阳药科大学学报, 2013, 30(6): 455-459.

Lyu JJ, Wang CX, Wei N, et al. Study on biological characteristics of spontaneous type 2 diabetic db /db mice [J]. J Shenyang Pharmaceutical University, 2013, 30(6): 455-459.

[9] Homo-Delarche F, Calderari S, Irminger J C, et al. Islet inflammation and fibrosis in a spontaneous model of type 2 diabetes, the GK rat [J]. Diabetes, 2006, 55(6): 16-25.

[10] 江丽青，王晓武，谭延振，等．GDF11对II型糖尿病小鼠心肌损伤的保护作用 [J]．中国实验动物学报，2017, 25(4): 362-367．

Jiang LQ，Wang XW，Tan YZ，et al. Protective effect of growth differentiation factor 11 on myocardial injury in type II diabetic mice [J]. Acta Lab Anim Sci Sin, 2017, 25(4): 362-367.

[11] Packer L, Kraemer K, Rimbach G. Molecular aspects of lipoic acid in the prevention of diabetes complications [J]. Nutrition, 2001, 17(10): 888-895.

[12] Liu J. The effects and mechanisms of mitochondrial nutrient alpha-lipoic acid on improving age-associated mitochondrial and cognitive dysfunction: an overview [J]. Neurochem Res, 2008, 33(1): 194-203.

[13] Jones W, Li X, Qu ZC, et al. Uptake, recycling, and antioxidant actions of α-lipoic acid in endothelial cells [J]. Free Radical Biol Med, 2002, 33(1): 83-93.

[14] Ames BN. Review article: Delaying the mitochondrial decay of aging—a metabolic tune-up [J]. Ann New York Acad Sci, 2004, 1019(5-6): 331-338.