Caco-2细胞单层模型中水飞蓟宾吸收机制研究

2018-05-04王湛博尤淋君

中国药科大学学报 2018年2期

胡林，童焕，丁茹，王湛博，尤淋君，杨劲*

（中国药科大学 1药物代谢动力学研究中心，南京210009；2新药安全评价研究中心，南京211198）

水飞蓟素是菊科植物水飞蓟（Silybum marianum（L.）Gaertn.）干燥果实的活性提取物。水飞蓟宾（silybin）是水飞蓟素的黄酮木质素类化合物的主要活性成分［1］，水飞蓟宾葡甲胺为水飞蓟宾的成盐衍生物，结构见图1。水飞蓟宾是公认的具有保肝作用的药物，在国内临床上应用于急慢性肝炎、脂肪肝的肝功能异常的恢复。目前国内市售的制剂有水飞蓟宾胶囊和水飞蓟宾葡甲胺片，其中胶囊剂是水飞蓟宾和卵磷脂复合物［2］。水飞蓟宾具有低水溶性和低脂溶性的物理特性，原料药口服生物利用度低［3］。通过在比格犬体内比较市售的水飞蓟宾胶囊和水飞蓟宾葡甲胺片、水飞蓟宾原料药羧甲基纤维素钠（CMC-Na）混悬液的绝对生物利用度（bioavailablity，BA）发现，水飞蓟宾原料药的绝对BA小于5%，胶囊剂和成盐片剂的绝对BA相比于原料药有很大的提高，但两者提高BA的程度有较大差异（结果另文发表）。目前仅有少数文献有部分水飞蓟宾的吸收机制的相关报道。水飞蓟宾的胃肠道吸收分数为20%～47%［4］，在大鼠单向肠灌流试验中发现水飞蓟宾在小肠吸收良好［5－6］，水飞蓟宾的表观渗透系数（Papp（AP-BL））约为3×10－7cm／s［7］，跨膜通透性低。这些研究结果不全面、不系统、机制不明确，且结论彼此矛盾。已证实药物在Caco-2单层细胞的渗透性与药物在人体中胃肠道吸收有良好的相关性，它是预测药物在人体吸收的金标准［8－9］。因此，本实验采用 Caco-2单层细胞模型研究不同浓度的水飞蓟宾和水飞蓟宾葡甲胺的双向跨膜转运通透性，为进一步改良水飞蓟宾的剂型，增加生物利用度，并减少生物利用度的变异提供理论基础。

Figure 1 Structure of silybin and silybin-N-meglumine

1 材料

1.1 药品和细胞株

水飞蓟宾原料药（纯度：98%，南京泽郎医药科技有限公司）；水飞蓟宾葡甲胺原料药（纯度：83.45%，南京宸翔医药研究有限责任公司）；氯唑沙宗对照品（纯度：99.99%，批号：100364-201302，中国食品药品检定研究院）；荧光黄［西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司］；盐酸普萘洛尔（纯度：99.00%）、阿替洛尔（纯度：99.00%）购于 Biochemistry公司；Caco-2细胞株购于中国科学院上海生命科学院细胞库，实验中所用的代数在20～45代之间。

1.2 试剂和材料

DMEM培养基（含 4.0 mmoL／L谷氨酰胺，4 500 mg／L葡萄糖）、胎牛血清（以色列Biological Industries公司）；青链霉素（美国 Hyclone公司）；0.25%胰蛋白酶、非必需氨基酸（美国 Gibco公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，美国ROE Scientific公司）；其他试剂均为分析纯；Millicell悬挂式培养小室（材料：聚酯膜，孔径：1.0μm，膜面积：0.3 cm2；美国 Millipore公司）；培养皿、24孔细胞培养板（上海圣纳堡生物科技开发有限公司）。

1.3 仪器

LC／MS／MS液质联用仪（4000 Q-Trap质谱仪，美国AB公司；Agilent 1290超高效液相仪，美国Agilent公司）；跨膜电阻仪（Millcell®-ERS-2，美国Millipore公司）；恒温振荡仪（浙江卓恒公司）；生物安全柜和CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；细胞计数仪（美国Nexcelom Bioscience公司）；多功能酶标仪（美国Perkin Elmer公司）。

2 方法

2.1 HBSS缓冲液中水飞蓟宾的检测

2.1.1 色谱条件色谱柱：Kinetex XB-C18（2.1×50 mm，2.6μm，Phenomenex公司）；流速：0.3 mL／min；柱温：30℃；进样盘温度：6℃；进样体积10μL；洗针液：甲醇-水（1∶1）；流动相：纯水（含0.1%甲酸，A相）；乙腈（B相）；梯度洗脱：0～0.5 min，20%B；0.5～1 min，20～65%B；1～2.4 min，65%B，2.4～2.5min，65% ～90%B；2.5～3.4 min，90%B；3.4～3.5 min，90% ～20%B；3.5～4.5 min，20%B。

2.1.2 质谱方法离子采集方式为多反应监测模式（MRM）。总时间4.5 min，切入质谱时间为1.2 min，切出质谱时间为2.8 min。气路参数：CUR：25 psi（1 ps＝6 894.8 Pa）；IS：－4 500 V；TEM：500℃；GS1：50 psi；GS2：50 psi。化合物参数：水飞蓟宾：定量离子对 481.2／300.8；DP：－100 V；CE：－28 V；CXP：－15 V；EP：－10 V。氯唑沙宗（内标）：定量离子对 168.1／131.7；DP：－65 V；CE：－27.6 V；CXP：－6 V；EP：－10 V。

2.1.3 水飞蓟宾标准曲线和质控样品的制备精密称取2份水飞蓟宾10.20 mg于10 mL量瓶中，用乙腈定容到刻度线，即得1 mg／mL的母液。其中一份稀释为标准曲线工作液：0.02，0.1，0.2，1，2，10，20，30μg／mL。另一份稀释为质控样品工作液：0.04，1.6，8，24μg／mL。分别精密移取标曲工作液和质控工作液10μL，加细胞温孵过空白HBSS缓冲液190μL，涡旋混匀，即得模拟标准曲线样品（1，5，10，50，100，500，1 000，1 500 ng／mL）和质控样品（2，80，400，1 200 ng／mL）。

2.1.4 前处理方法移液枪移取样品30μL加氯唑沙宗乙腈溶液（内标，54 ng／mL）10μL，混匀后，加乙腈（析出缓冲盐）270μL涡旋混匀，12 000 r／min，4℃，离心 5 min，取上清液 75μL与超纯水75μL混匀进样。

2.2 HBSS缓冲液中阿替洛尔和普萘洛尔的检测

2.2.1 色谱条件色谱柱：Poroshell 120 EC-C18（3.0 mm×50 mm，2.7μm）；流速：0.3 mL／min；柱温：30℃；进样盘温度：6℃；进样体积5μL；洗针液：甲醇-水（1∶1）；流动相：纯水（含0.1%甲酸，A相）；乙腈（B相）；梯度洗脱：0～0.6 min，10%B；0.6～0.8min，10% ～65%B；0.8～2.4min，65%B，2.4～2.5min，65% ～90%B；2.5～3.1min，90%B；3.1～3.2 min，90% ～10%B；3.2～4.5 min，10%B。

2.2.2 质谱方法气路参数：CUR：28 psi；IS：4 500 V；TEM：400℃；GS1：10 psi；GS2：10 psi。化合物参数：阿替洛尔：定量离子对267.6／145.3；DP：60 V；CE：40 V；CXP：13 V；EP：15 V。普萘洛尔：定量离子对 260.6／116.4；DP：47 V；CE：25 V；CXP：10 V；EP：10 V。奥美拉唑（内标）：定量离子对346.7／198.3；DP：35 V；CE：15 V；CXP：10 V；EP：10 V。总时间4.5 min，切入质谱时间为0.5 min，切出质谱时间为2.5 min。

2.2.3 普萘洛尔和阿替洛尔的标准曲线和质控样品的制备精密称取阿替洛尔10.00 mg、盐酸普萘洛尔11.45 mg，分别放置于10 mL量瓶中，用甲醇定容到刻度线，即得1 mg／mL的母液。分别精密移取阿替洛尔母液（1 mg／mL）和普萘洛尔母液（1mg／mL）1mL置于10mL量瓶中，用甲醇定容到刻度线即得100μg／mL的混合母液。使用混合母液依次稀释标准曲线工作液：0.04，0.1，0.2，0.4，1，2，4，10μg／mL。按上述操作制备另一份混合母液依次稀释为质控样品工作液：0.1，0.8，8μg／mL。分别精密移取标曲工作液和质控工作液10μL，加细胞温孵过空白HBSS缓冲液190μL，涡旋混匀，即得模拟标准曲线样品和质控样品。

2.3 荧光黄的检测

精密称取荧光黄15.65 mg于100 mL量瓶中，使用HBSS缓冲液定容至刻度，即得300μmol／L荧光黄溶液。用HBSS逐级稀释300μmol／L荧光黄为 5，10，50，100，500，1 000 nmol／L标曲工作溶液，采用多功能酶标仪，激发波长466 nm，发射波长522 nm测量标准曲线和样品的荧光强度。

2.4 Caco-2细胞模型的建立和评价

小室中的接种与培养：取状态良好的复苏第4代之后的细胞，用细胞计数仪计数，并调整细胞密度至每毫升1.0×105个，接种24 h后更换培养液，第1周隔天换液，1周后每天换液，培养21 d。细胞单层完整性的形成：将Caco-2细胞按上述接种密度接种到直径为35 mm的培养皿，在接种后第1，3，7，12，21天使用倒置显微镜拍照。细胞单层致密性的形成：使用Millicell®-ERS跨膜电阻仪测定Caco-2细胞接种到小室后的第1，3，7，12，21天的电阻值。检测细胞单层的渗透性：测定300μmol／L荧光黄AP-BL侧的通透性。

2.5 给药组和阳性对照组的转运实验

2.5.1 药物的配制

给药组：分别精密称取水飞蓟宾102.04 mg和水飞蓟宾葡甲胺119.83 mg于10 mL量瓶中，用DMSO溶液定容至刻度线即得10 mg／mL的母液。分别将给药组母液用HBSS缓冲液稀释成：水飞蓟宾 HBSS（5，20，50μg／mL）；水飞蓟宾葡甲胺 HBSS（28μg／mL，体系中的 DMSO含量最终不超过0.5%）。

阳性对照组：分别精密称取盐酸普萘洛尔148.00 mg和阿替洛尔133.20 mg于10 mL量瓶中，用甲醇定容到刻度线即得50 mmoL／L的母液，转运实验时取上述母液50μL于50 mL量瓶中，用HBSS缓冲液分别稀释1 000倍即得所需实验浓度的普萘洛尔（50μmoL／L）和阿替洛尔（50μmoL／L）的HBSS溶液。

2.5.2 最大药物浓度和溶剂对单层电阻值的影响

细胞在小室中培养21 d后，分别在给予50μg／mL水飞蓟宾的1 h和2 h测定Caco-2细胞单层的电阻值。给药2 h后将给药孔两侧更换为细胞培养液，在更换培养基后24 h再次测定给药孔的电阻。

2.5.3 正式转运实验小室中细胞培养21 d后，选取电阻合格的孔室进行正式的转运实验。取出细胞板后倒掉小室两侧的培养基，用HBSS清洗3次，第3次在培养箱中孵30 min。对AP侧到BL侧的转运：AP侧加含药的HBSS缓冲液200μL，作为给药侧，BL侧加入空白HBSS缓冲液1 000μL，作为接收侧；对于BL侧到AP侧的转运：BL侧加入含药的 HBSS缓冲液1 000μL，作为给药侧，AP侧加入空白HBSS缓冲液200μL，作为接收侧。给药后将培养板置于37℃恒温振荡仪孵育，分别于30、60、90和120 min在接受侧收取溶液100μL，取样后同时加入空白预热的HBSS液100μL。试验结束后收集两侧溶液，计算回收率。

2.6 数据的计算与处理

2.6.1 表观通透系数（Papp）的计算

dQ／dt为单位时间内药物通过Caco-2细胞单层的转运量，以药物的累积转运量（Q）对取样时间（t）作图后，该直线的斜率为 dQ／dt；A为小室的膜面积，0.3 cm2；C0为给药测药物的初始浓度。

2.6.2 药物外排率的计算

若药物的ER大于2，说明药物的吸收过程可能有外排转运体参与。

2.6.3 回收率的计算［10］

计算公式中Mr-120是接受侧120 min时药物的累积转运量，包括取出样品中的药物量，Md-120给药侧剩余药量，Md-0实验开始时给药侧的总药量。

2.6.4 统计分析所有实验数据以¯x±s表示。采用两独立样本的双侧t检验对两组数据进行统计分析，采用单因素方差分析对多组数据进行统计学分析。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表明差异有显著性意义。

3 结果

3.1 水飞蓟宾HBSS缓冲液中方法学验证

特异性：在本试验的LC-MS／MS条件下，水飞蓟宾的出峰时间为1.80 min，内标氯唑沙宗的出峰时间为1.83 min。空白样本、水飞蓟宾以及内标的特异性色谱图见图2。

残留效应：在高浓度样本ULOQ进样分析后，接着分析空白样本，本方法未观察到残留效应。

标准曲线和定量下限：按“2.1.3”和“2.1.4”步骤处理标准曲线样品并同时制备空白样本及含内标的空白样本，进行LC-MS／MS分析。以待测物峰面积As和内标峰面积Ai的比值f（f＝As／Ai），对待测物浓度c作权重回归计算，选1／c2为权重因子得出标准曲线方程，水飞蓟宾：y＝0.012 5x＋0.006 29，r＝0.996 6（n＝8）。表明水飞蓟宾在 1～1 500 ng／mL内线性关系良好。水飞蓟宾LLOQ为 1 ng／mL，准确度为 83.7% ～118.0%，RSD为13.8%。

稀释效应：考察了超限样品稀释5，20，50倍，其中 RSD在2.7～5.7%之间，RE在－5.1% ～－9%。

准确度和精密度：按“2.2.3”和“2.2.4”步骤处理质控样品，2 d完成3个分析批，批间和批内的RE在－5.6%～2.9%，批间和批内 RSD在4.1%～14.5%。

水飞蓟宾在HBSS缓冲液中的稳定性：准确度在±15%，RSD均小于15%。各项结果均符合要求FDA生物样本分析方法学验证的要求［11］，表明此检测方法稳定可靠。

3.2 Caco-2细胞单层的生长过程

倒置显微镜下观察到的Caco-2细胞单层从接种到小室中的第1天到第21天的生长过程见图3。到第21天时，Caco-2细胞基本无间隙，形成紧密连接。

Figure 2 Representative MRM chromatograms of（A）silybin and（B）chlorzoxazone（IS）for（I）blank HBSS buffer and（II）blank sample spiked with silybin，chlorzoxazone.Arrows indicate retention time of silybin and IS

Figure 3 Growth process of Caco-2 cellmonolayermodel after seeding（×100）

3.3 Caco-2细胞单层形成过程中跨膜电阻值变化

Caco-2细胞接种到小室后，从第1周到第2周TEER随着接种的时间逐渐增大，直到第3周时TEER增长极其缓慢，几乎达到饱和，不再增长。到第21天时TEER已超过350Ω·cm2。TEER值易受多种因素的影响，一般Caco-2细胞培养到15～21 d时，达到一个稳定值，不同的实验环境会得到不同的TEER，有的低至150Ω·cm2，有的高至900Ω·cm2。结合本实验中TEER已达稳定的趋势以及荧光黄的Papp呈现低渗透性的特点，表明本实验中Caco-2细胞单层模型的致密性良好［12］。

3.4 荧光黄、阿替洛尔和普萘洛尔细胞单层的渗透性结果

Caco-2细胞在小室中培养21 d后，荧光黄（300μmoL／L）、阿替洛尔（50μmoL／L）、普萘洛尔（50μmoL／L）的细胞单层渗透性结果见表2。荧光黄的Papp在5.83～7.03×10－10cm／s之间，远远小于1×10－7cm／s，表明此孔的紧密连接合格［7］。文献中报道的阿替诺尔Papp约为2.01×10－7cm／s，普萘洛尔Papp约为 4.19×10－5cm／s［8，13］，本研究所得的阿替洛尔的Papp远远低于普萘洛尔，并且两者的Papp与文献中报道相接近。结果表明本实验成功建立了Caco-2细胞单层模型。

Table 1 Change of TEER value during Caco-2 cellmonolayer formation

TEER：Transepithelial eletrical resistance

Time of cultivation／d TEER／（Ω·cm2）11.5±3.12 3 25.3±1.25 7 168.1±3.30 12 335.4±4.25 1 21 366.4±7.67

Table 2 P app value of lucifer yellow and positive control drugsn＝3）

AP：Apical；BL：Basal

Group Direction：AP-BL P app¯x±s Propranolol（50μmoL／L） 15.12×10－6 （13.85±1.53）×10－6 14.28×10－6 12.16×10－6 Atenolol（50μmoL／L） 0.79×10－6 （0.77±0.04）×10－6 0.73×10－6 0.81×10－6 Lucifer yellow（300μmoL／L） 5.88×10－10 （6.25±0.68）×10－10 5.83×10－10 7.03×10－10

3.5 水飞蓟宾的最大浓度和溶剂对单层电阻值的影响

在Caco-2细胞单层的AP侧给予50μg／mL水飞蓟宾后，使用跨膜电阻仪检测细胞单层的电阻值变化，见表3。TEER变化很小，表明实验过程中细胞单层的完整性不受影响。

Table 3 TEER of Caco-2 monolayer was observed after adding50μg／mL silybin in apical side

The time after silybin added to apical side／h TEER／（Ω·cm2）0 366.4±7.67 1 358.2±5.74 2 333.6±3.24 24 354.7±3.15

3.6 水飞蓟宾双向转运结果

同一浓度水平的药物，随着时间的增加，药物的累积转运量呈线性增加；同一时间点，随着浓度的增加，药物的累积转运量也增加，见图4，说明药物的转运量具有时间（r＞0.99）和浓度的相关性。低、中、高3个浓度水平的水飞蓟宾和中浓度的水飞蓟宾葡甲胺Papp（AP-BL）平均值分别为 2.01×10－6cm／s；2.93×10－6cm／s；3.81×10－6cm／s；2.70×10－6cm／s，Papp（BL-AP）平均值分别为 14.52×10－6cm／s；13.09×10－6cm／s；11.86×10－6cm／s；9.77×10－6cm／s（图5）。由Papp（AP-BL）大于2×10－6cm／s，可判断水飞蓟宾有良好的通透性［14］，水飞蓟宾溶解度低，在BSC系统中为Ⅱ类药物。结果显示ER远远大于2（图6），表明水飞蓟宾的吸收过程中可能有外排转运体的参与。低浓度组的Papp（AP－BL）与高浓度组的存在显著性差异（P＜0.05），随着水飞蓟宾浓度的增加ER值有减少的趋势，可能是由于药物高浓度时外排转运体被饱和，这一现象与文献中报道的水飞蓟宾为P-gp底物，可抑制P-gp活性的结论相一致［15］。此外中浓度的水飞蓟宾和水飞蓟宾葡甲胺的Papp相近，表明水飞蓟宾成盐对于跨膜通透性没有改变。

Figure 4 Relationship between cumulative transport amount and time of silybin and silybin-N-meglumine（AP-BL）

Figure5 P app valuesof silybin and silybin-N-meglumine（¯x±s，n＝3）*P＜0.05

Figure 6 Efflux ratio of silybin and silybin-N-meglumine**P＜0.01，***P＜0.001

3.7 Caco-2细胞转运回收率的计算

在Caco-2细胞转运实验的最后一个时间点同时取给药测和接受测的样品，检测给药初始浓度和给药测浓度，由表4可知平均回收率在80%～94%之间，说明细胞单层对药物的吸附和溶剂的蒸发基本对实验结果无影响，实验中得到的Papp是准确的［9］。

Table 4 Recovery of in transport in Caco-2 cell

M d-120：Residue of silybin at120 min on the administration side；M r-120：Cumulative transportamountof silybin at120 min in receiving side；M d-0：Total amount of silybin at the beginning

Group Direction c／（μg／mL） M d-120／（ng） M r-120／（ng） M d-0／（ng）Recovery／%Silybin AP-BL 5 843±32 19±3 1 020±14 85±3 20 2 928±236 117±13 3812±7 80±6 50 8 597±1 480 365±81 10 700±11 84±13 Silybin-N-meglumine 28 2 590±139 103±9 3 342±6 81±4 Silybin BL-AP 5 4 480±160 144±12 5 100±69 91±3 20 16 880±216 475±7 19 060±37 91±1 50 44 733±2 380 1 062±153 53 500±57 86±4 Silybin-N-meglumine 28 15 340±1 588 372±16 16 710±30 94±9

4 讨论

本实验在Caco-2模型中初步考察了水飞蓟宾吸收机制，为改良已有的上市剂型，增加生物利用度，并同时减少变异提供理论依据。水飞蓟宾双向转运实验表明水飞蓟宾的跨膜通透性良好，可判断水飞蓟宾在BSC系统中为Ⅱ类药物，水飞蓟宾在胃肠道中的释放是其吸收过程的重要影响因素，增加水飞蓟宾的溶解度和溶出速率，可提高其口服生物利用度。市售的水飞蓟宾卵磷脂复合物的胶囊剂和水飞蓟宾成盐片剂在比格犬体内生物利用度实验的结果表明胶囊剂和成盐片剂的绝对生物利用度相比于原料药均有极大的提高，这与本实验的结果相一致。为进一步明确胶囊剂与成盐片剂提高口服生物利用度的程度不同的原因，还需通过体外溶出实验考察药物磷脂复合物的形成、成盐、晶型、减小粒径对药物释放的影响。此外，Caco-2细胞模型在研究由转运体参与和细胞旁介导的吸收时有其局限性［16］，在本实验中发现可能有外排转运体参与水飞蓟宾的吸收，因此除了Caco-2细胞模型外还需使用其他方法来进一步研究水飞蓟宾的吸收机制。

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