抗AGR2单克隆抗体18A4抑制细胞外AGR2诱导的肿瘤细胞活性

于天弘，Siva Bharath MERUGU＃，Hema NEGI＃，孙宋暄，丁云鹤，武正华*，李大伟，3**

（上海交通大学 1药学院，上海200240；2生物医学工程学院；3细胞工程及抗体药物教育部工程研究中心，上海200240）

前梯度蛋白2（anterior gradient2，AGR2）是蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，PDI）家族的成员，具有促进蝾螈断肢再生［1］、皮肤伤口愈合［2］和在胰腺组织再生的过程中激活表皮生长因子受体信号通路等作用［3］。AGR2也是一种肿瘤相关蛋白，在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌等肿瘤组织中过表达［4－8］。细胞内AGR2在肿瘤中与肿瘤增殖、存活、迁移、黏附、不良预后、耐药等特性息息相关［9－12］。另外，在肿瘤组织中，AGR2可以被分泌至细胞外并能在肿瘤病人的血液和尿液中被检测到［13－14］。细胞外的AGR2是肿瘤微环境中的重要参与者，已知的功能有导致前列腺基质细胞的程序性死亡［15］，影响上皮细胞的极性和黏附，引起上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［16］，与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）结合，增强 VEGF和 FGF形成二聚体的能力，继而促进血管内皮细胞和成纤维细胞向肿瘤组织迁移，引起血管生成［17］。这些特性都说明AGR2是一个潜在的抗肿瘤靶点。

本课题组通过杂交瘤技术制备了以AGR2为靶点的单克隆抗体，命名为18A4［18］。初步药效实验发现，18A4能够抑制AGR2表达阳性的乳腺癌细胞的生长和迁移［19］，通过抑制血管生成的功能减缓了SKOV3卵巢癌细胞的裸鼠移植瘤的生长［17，20］。但18A4的药理活性研究仍然存在拓展的空间。本研究运用两种自身不表达AGR2的黑色素瘤细胞，将AGR2蛋白和18A4同时作用于细胞，观察18A4抗体能否抑制细胞外AGR2引起的肿瘤细胞活性。

1 材 料

1.1 试 剂

单克隆抗体18A4，His标签AGR2蛋白由本实验室构建、表达、纯化［2，18］。人黑色素瘤细胞 A375，小鼠黑色素瘤细胞B16-F10购自美国ATCC中心。DMEM基础培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清、青霉素-链霉素混合液；MTT、结晶紫（索莱宝生物科技有限公司）；细胞周期与细胞凋亡试剂盒（碧云天生物技术研究所）；罗丹明标记鬼笔环肽、DAPI（美国Millipore公司）；兔抗人p53抗体（美国Proteintech公司）；鼠抗β-actin抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；IRDye 680CW标记的羊抗兔抗体、IRDye 800CW标记的羊抗鼠抗体（美国Odyssey公司）；Dylight488，Dylight594标记的羊抗兔抗体（联科生物有限公司）。

1.2 仪 器

FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）；酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；激光共聚焦显微镜（德国徕卡公司）；Odyssey双色红外激光成像仪（美国Li-Cor有限公司）。

2 方 法

2.1 细胞培养

A375和B16-F10细胞分别在含10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素混合液的DMEM培养基，37℃、含5%CO2的培养箱中培养。取对数期生长的细胞进行实验。细胞增殖、细胞周期、细胞迁移、细胞形态观察实验分成空白对照组和AGR2组（50，100 ng／mL）；18A4组（20μg／mL）及 AGR2＋18A4组（100 ng／mL AGR2＋20μg／mL 18A4）。Western blot和免疫荧光实验分成空白对照组和阿霉素组（1μmol／L）；阿霉素＋AGR2组（1μmol／L阿霉素 ＋100 ng／mL AGR2）及阿霉素 ＋AGR2＋18A4组（1μmol／L阿霉素 ＋100 ng／mL AGR2＋20μg／mL 18A4）。

2.2 MTT法检测AGR2和18A4抗体对A375和B16-F10细胞增殖的影响

取对数生长期细胞，以每孔5×103个细胞接种于96孔板。37℃、5%CO2培养24 h，加药，每组设8个复孔。培养24 h后每孔加入5 mg／mL MTT 20μL，继续培养4 h。吸去培养基，每孔加入DMSO 150μL，振荡10 min使结晶溶解。酶标仪测定490 nm下的吸收度，计算细胞生长的抑制率：抑制率＝（对照组吸收度的平均值－实验组吸收度的平均值）／（对照组吸收度的平均值）×100%。

2.3 克隆形成实验测AGR2和18A4抗体对A375和B16-F10细胞增殖的影响

取对数生长期细胞，以每孔2×103个细胞接种于6孔板。37℃、5%CO2培养24 h，加药。37℃、5%CO2培养10 d。吸去培养基，PBS洗涤后每孔加入0.5%结晶紫500μL，染色30 min。PBS洗涤，拍照，计数。

2.4 流式细胞仪检测AGR2和18A4抗体对A375和B16-F10细胞周期的影响

取对数生长期细胞，以每孔5×105个细胞接种于6孔板。37℃、5%CO2培养24 h，加药。37℃、5%CO2培养24 h。胰酶消化收集所有细胞，70%乙醇固定过夜。PBS洗涤后PI染色，37℃避光水浴30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

2.5 划痕实验检测AGR2和18A4抗体对A375和B16-F10细胞迁移的影响

取对数生长期细胞，以每孔1×106个细胞接种于6孔板。37℃、5%CO2培养至细胞长满。换成0.5%胎牛血清的DMEM培养基刺激24 h。用200μL枪头在孔内划痕，PBS洗涤后加药，37℃、5%CO2培养24 h。在0 h和24 h，每个划痕拍照4张，分析两个时间点上划痕宽度的变化。

2.6 鬼笔环肽染色检测AGR2和18A4抗体对A375和B16-F10细胞形态的改变

取对数生长期细胞，以每孔2×105个细胞接种于含细胞爬片的12孔板。37℃、5%CO2培养24 h。加药，继续培养24 h。PBS洗涤后取细胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤后加罗丹明交联的鬼笔环肽，避光染色45 min。PBS洗涤，DAPI避光染色5 min。抗荧光淬灭剂封片，激光共聚焦显微镜镜检，拍照。

2.7 Western blot检测 AGR2和 18A4抗体对A375和B16-F10细胞中p53表达量的影响

取对数生长期细胞，以每孔1×106个细胞接种于6孔板。37℃、5%CO2培养24 h。加药，继续培养24 h。胰酶消化收集所有细胞，PBS洗涤后加入预冷、含蛋白酶抑制剂的NP40细胞裂解液裂解，每个样品中加入等体积的5×上样缓冲液，混匀，95℃水浴5 min，－20℃储存备用。样品经10%SDS-PAGE分离，将分离的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，恒流300 mA转膜1 h。在5%脱脂奶中室温振荡封闭1 h。加1∶1 000稀释的兔抗人p53抗体，鼠抗β-actin抗体，4℃孵育过夜，TNET溶液洗膜10 min×3次。加1∶5 000稀释的IRDye 680CW标记的羊抗兔抗体或IR Dye 800CW标记的羊抗鼠抗体，室温孵育1 h，TNE-T溶液（10 mmol／L Tris-base，2.5 mmol／L EDTA-2Na，50 mmol／L NaCl，0.1%Tween-20）洗膜 10 min×3次。双色红外激光成像仪扫膜，用Quantity One软件分析蛋白条带的深浅。

2.8 免疫荧光分析AGR2和18A4抗体对A375和B16-F10细胞中p53表达量的影响

取对数生长期细胞，以每孔2×105个细胞接种于含细胞爬片的12孔板。37℃、5%CO2培养24 h。加药，继续培养24 h。PBS洗涤后取细胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%Triton X-100通透15 min，5%羊血清封闭1 h。加1∶200稀释的兔抗人p53抗体，室温孵育2 h，PBS洗涤。加1∶500稀释的 Dylight488或Dylight594标记的羊抗兔抗体，室温避光孵育1 h，PBS洗涤。DAPI避光染色5 min，抗荧光淬灭剂封片，激光共聚焦显微镜镜检，拍照。

2.9 数据分析

用GraphPad Prism 5软件进行数据统计学分析，对两组样本采用Student′sT-test比较差异显著性。P＜0.05表示有显著性差异。

3 结 果

3.1 18A4抗体对胞外AGR2引起的细胞增殖加快的抑制作用

运用MTT实验测定细胞外AGR2和18A4对两种黑色素瘤细胞A375和B16-F10增殖的影响。结果发现，加入50 ng／mL AGR2刺激24 h仅显著加快B16-F10的增殖，而100 ng／mL AGR2能同时显著提高A375和B16-F10细胞的增殖，分别高于对照组生长率（34.74±7.69）%和（29.87±5.02）%。而在加入100 ng／mL AGR2的基础上加入20μg／mL 18A4，与 AGR2组相比，两种细胞的生长率均有显著的降低，分别降低了（43.99±5.93）%和（33.63±6.48）%，如图1所示。

用克隆形成实验再次验证MTT实验的现象。与对照组相比，100 ng／mL AGR2单独作用后，A375和B16-F10细胞形成克隆的数量分别显著增加了（49.00±7.12）%和（36.67±7.77）%。而在100 ng／mL AGR2和20μg／mL 18A4同时作用的条件下，A375和B16-F10细胞形成克隆的数量与AGR2组相比分别减少了（32.00±8.64）%和（27.33±8.50）%，如图1C，1D所示。两项实验均表明18A4抗体能抑制胞外AGR2引起的肿瘤细胞增殖加快。

Figure 1 Monoclonal antibody 18A4 blocked the proliferation enhancement induced by extracellular AGR2 in melanoma cells（¯x±s，n＝3）A：MTT assay of AGR2 and mab 18A4 on the proliferation of A375 cells；B：MTT assay of AGR2 andmab 18A4 on the proliferation of B16-F10 cells；C：Colony formation assay of A375 and B16-F10 cells treated with AGR2，18A4 or a combination of them；D：Quantification of colony numbers in histograms*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs control group，＃P＜0.05；＃＃＃P＜0.001 vs AGR2 group

3.2 18A4抗体对胞外AGR2引起的细胞周期改变的抑制作用

细胞增殖与细胞周期调控密切相关，故通过流式细胞仪检测胞外AGR2与18A4抗体对两种黑色素瘤细胞周期的影响。与对照组相比，AGR2组细胞的G1期比例分别减少了（10.02±1.92）%和（7.73±1.70）%，S期比例分别增加了（9.09±1.85）%和（8.01±1.23）%，统计结果表明 AGR2组与对照组存在显著性差异。所以胞外AGR2能引起肿瘤细胞G1／S细胞周期转化。而与AGR2组相比，AGR2＋18A4组细胞的G1期比例分别增加了（7.39±1.37）%和（7.60±1.40）%，S期比例分别减少了（6.78±1.12）%和（6.76±0.78）%，统计结果表明AGR2＋18A4组与AGR2组存在显著性差异，如图2所示。所以18A4抗体能抑制胞外AGR2引起的G1／S细胞周期转化。

Figure 2 Monoclonal antibody 18A4 hindered the cell cycle transition induced by extracellular AGR2 in melanoma cells（¯x±s，n＝3）A：Flow cytometry analysisof AGR2 andmab 18A4 on the cell cycle of A375 cells；B：Flow cytometry analysisof AGR2 andmab 18A4 on the cell cycle of B16-F10 cells；C：Statistical analysis of G1 and S phase distributions in histograms*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs AGR2 group

3.3 18A4抗体对胞外AGR2引起的细胞迁移加快和细胞形态变化的抑制作用

通过细胞划痕实验分析胞外AGR2和18A4抗体对细胞迁移的影响。结果表明，AGR2组细胞的迁移速度分别比对照组细胞提高了（27.88±8.61）%和（49.81±10.64）%，两组间有显著性差异。而AGR2＋18A4组细胞的迁移速度分别比AGR2组细胞降低了（21.21±8.36）%和（40.21±10.22）%，两组间有显著性差异，如图 3A～3D所示。

细胞迁移与细胞形态的变化相关，进一步用鬼笔环肽染色法观察AGR2和18A4抗体对两种黑色素瘤细胞形态的影响。研究发现与对照组上皮细胞形态相比，AGR2组的细胞均呈现成纤维细胞的形态，而AGR2＋18A4组的细胞仍然维持上皮细胞的形态（图3E，3F），说明胞外AGR2能够改变肿瘤细胞的形态，而18A4抗体能抑制 AGR2的这一作用。

3.4 18A4抗体对胞外AGR2引起的p53表达量变化的抑制作用

选择检测抑癌基因p53的表达量来观察胞外AGR2和18A4抗体对细胞信号的影响。为了更清晰地观察p53表达量的变化，加入1μmol／L阿霉素来增加p53的表达量。Western blot结果显示，阿霉素组A375和B16-F10细胞的p53表达量分别达到对照组表达量的（8.41±1.91）倍和（5.90±0.94）倍，上调明显。与阿霉素组相比，阿霉素＋AGR2组细胞的p53表达量又明显降低，分别是阿霉素组p53表达量的（27.33±4.15）%和（25.50±7.39）%，两组间有显著性差异，说明胞外AGR2降低了p53的表达量。而阿霉素＋AGR2＋18A4组细胞p53表达量与阿霉素＋AGR2组相比有明显的回升，分别是阿霉素＋AGR2组p53表达量的（3.22±0.57）倍和（3.85±1.09）倍，两组间有显著性差异，说明胞外AGR2对p53表达量的影响被18A4抗体中和，如图4A～4D所示。

为了再次验证Western blot的结果，进一步用免疫荧光染色法检测各组细胞的p53表达量。实验结果与Western blot的结果类似，同时在两种细胞内发现，阿霉素明显提升了荧光强度，即p53表达量。阿霉素＋AGR2组细胞的荧光强度与阿霉素组相比明显回落，而阿霉素＋AGR2＋18A4组细胞的荧光强度又明显回升，如图4E，4F所示。Western blot和免疫荧光的结果均说明胞外AGR2引起肿瘤细胞p53表达量降低的现象能被18A4抗体所抑制。

Figure 3 Monoclonal antibody 18A4 decreased themigration acceleration and morphological changes induced by extracellular AGR2 inmelanoma cellsA：Wound healing assay of AGR2 and mab 18A4 on themigration of A375 cells；B：Statistical analysis of A375 cellmigration in histograms；C：Wound healing assay of AGR2 andmab 18A4 on themigration of B16-F10 cells；D：Statistical analysisof A375 cellmigration in histograms；E：Cellmorphology staining of A375 cells with corresponding treatments；F：Cellmorphology staining of B16-F10 cells with corresponding treatments*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs AGR2 group

Figure 4 Monoclonal antibody 18A4 masked the decline of p53 expression level induced by external AGR2A：Western blot analysis of p53 expression in A375 cells with corresponding treatments；B：Western blot analysis of p53 expression in B16-F10 cells with corresponding treatments.β-actin was served as an internal control；C：Statistical analysis of the band intensities on Western blots as compared to β-actin bands in A375 cells；D：Statistical analysisof the band intensities onWestern blotsas compared toβ-actin bands in B16-F10 cells；E：Immunofluorescence assay of p53 expression in A375 cells；F：Immunofluorescence assay of p53 expression in B16-F10 cells*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05 vs AGR2 group

4 讨 论

AGR2在多种肿瘤组织中过表达，细胞内和细胞外AGR2均与肿瘤增殖、转移、耐药等有关，所以AGR2是一个潜在的抗肿瘤靶点。虽然科学家们已经提出了若干种抑制AGR2功能的策略，但是针对AGR2的药物至今尚未出现［21］。故本研究探究了以AGR2为靶点18A4抗体能否抑制细胞外AGR2引起的肿瘤细胞活性。

首先通过MTT实验和克隆形成实验发现了18A4抗体能够抑制细胞外AGR2引起的肿瘤细胞增殖加快，并进一步检测胞外AGR2与18A4对细胞周期的影响。敲降细胞内AGR2能够让乳腺癌和前列腺癌细胞阻滞在 G1期［22－23］，但胞外 AGR2能否影响细胞周期还是未知的。本研究中细胞周期检测结果说明胞外AGR2的刺激能够减少G1期细胞，增加S期细胞。更重要的，胞外AGR2对肿瘤细胞周期的调控能被18A4抗体抑制。

AGR2与肿瘤细胞的迁移有着紧密的联系。敲降胞内AGR2可减慢肿瘤细胞的侵袭性，反之，将AGR2转染入肿瘤细胞，细胞的迁移能力明显增强［8，24－25］。同样的，胞外 AGR2促进了上皮细胞的迁移，引起 EMT，加快伤口愈合［2，16］。所以本研究通过划痕实验和细胞形态染色检测18A4能否缓解胞外AGR2导致的肿瘤细胞迁移加快和细胞形态变化。本研究结果证实18A4抗体具有减缓胞外AGR2引起的细胞迁移加快和形态变化。

p53是经典的抑癌基因，超过半数的肿瘤组织中存在p53的突变和缺失［26］。Hrstka等［27］发现胞内AGR2通过双特异性磷酸酶10（DUSP10，dual specificity protein phosphatase 10）的调控降低p53的活性，但胞外AGR2能否影响p53的表达还是未知的。本研究用阿霉素处理肿瘤细胞以增加p53的表达量，通过Western blot和免疫荧光染色说明胞外AGR2的刺激能够降低 p53的表达量，而18A4抗体能够稳定p53的表达量，抑制AGR2对p53表达量的影响。

综上所述，18A4抗体能够抑制胞外AGR2引起的肿瘤细胞活性，包括增殖速度加快、G1／S细胞周期转变、迁移速度加快、细胞形态的改变和p53表达量的降低，这些结果不仅延伸了18A4的药理作用，也说明18A4是一种潜在的抗肿瘤药物。

［1］ Kumar A，Godwin JW，Gates PB，et al．Molecular basis for the nerve dependence of limb regeneration in an adult vertebrate［J］.Science，2007，318（5851）：772－777.

［2］ Zhu Q，Mangukiya HB，Mashausi DS，et al．Anterior gradient2 is induced in cutaneous wound and promotes wound healing through its adhesion domain［J］.FEBS J，2017，284（17）：2856－2869.

［3］ Wodziak D，Dong A，Basin MF，et al．Anterior gradient 2（AGR2）induced epidermal growth factor receptor（EGFR）signaling is essential formurine pancreatitis-associated tissue regeneration［J］.PLoSOne，2016，11（10）：e0164968.

［4］ Liu D，Rudland PS，Sibson DR，et al．Human homologue of cement gland protein，a novel metastasis inducer associated with breast carcinomas［J］.Cancer Res，2005，65（9）：3796－3805.

［5］ Ramachandran V，Arumugam T，Wang H，et al．Anterior gradient 2 is expressed and secreted during the development of pancreatic cancer and promotes cancer cell survival［J］.Cancer Res，2008，68（19）：7811－7818.

［6］ Zhang JS，Gong A，Cheville JC，et al．AGR2，an androgen-inducible secretory protein overexpressed in prostate cancer［J］.Genes Chromosomes Cancer，2005，43（3）：249－259.

［7］ Fritzsche FR，Dahl E，Dankof A，et al．Expression of AGR2 in non small cell lung cancer［J］.Histol Histopathol，2007，22（7）：703－708.

［8］ Park K，Chung YJ，So H，etal．AGR2，amucinous ovarian cancer marker，promotes cell proliferation and migration［J］.Exp Mol Med，2011，43（2）：91－100.

［9］ Chevet E，Fessart D，Delom F，et al．Emerging roles for the prooncogenic anterior gradient-2 in cancer development［J］.Oncogene，2013，32（20）：2499－509.

［10］Brychtova V，Vojtesek B，Hrstka R.Anterior gradient 2：a novel player in tumor cell biology［J］.Cancer Lett，2011，304（1）：1－7.

［11］Li Z，Zhu Q，Hu L，et al．Anterior gradient2 is a binding stabilizer of hypoxia inducible factor-1alpha that enhances CoCl2-induced doxorubicin resistance in breast cancer cells［J］.Cancer Sci，2015，106（8）：1041－1049.

［12］Li Z，Zhu Q，Chen H，et al．Binding of anterior gradient2 and estrogen receptor-alpha：dual critical roles in enhancing fulvestrant resistance and IGF-1-induced tumorigenesis of breast cancer［J］.Cancer Lett，2016，377（1）：32－43.

［13］ Bu H，Bormann S，Schafer G，et al．The anterior gradient 2（AGR2）gene is overexpressed in prostate cancer and may be useful as a urine sedimentmarker for prostate cancer detection［J］.Prostate，2011，71（6）：575－587.

［14］Edgell TA，Barraclough DL，Rajic A，etal．Increased plasma concentrations of anterior gradient2 protein are positively associated with ovarian cancer［J］.Clin Sci（Lond），2010，118（12）：717－725.

［15］Vitello EA，Quek SI，Kincaid H，et al．Cancer-secreted AGR2 induces programmed cell death in normal cells［J］.Oncotarget，2016，7（31）：49425－49434.

［16］Fessart D，Domblides C，Avril T，et al．Secretion of protein disulphide isomerase AGR2 confers tumorigenic properties［J］.Elife，2016，5：e13887.

［17］Guo H，Zhu Q，Yu X，et al．Tumor-secreted anterior gradient-2 binds to VEGF and FGF2 and enhances their activities by promoting their homodimerization［J］.Oncogene，2017，36（36）：5098－5109.

［18］Wu ZH，Zhu Q，Gao GW，et al．Preparation，characterization and potential application ofmonoclonal antibody 18A4 against AGR2［J］.Chin J Cell Mol Immunol（细胞与分子免疫学杂志），2010，26（1）：49－51.

［19］李坤.AGR2单克隆抗体18A4抑制乳腺癌细胞的生长和迁移［D］.上海：上海交通大学，2011.

［20］Guo H，Chen H，Zhu Q，et al．A humanized monoclonal antibody targeting secreted anterior gradient2 effectively inhibits the xenograft tumor growth［J］.Biochem Biophys ResCommun，2016，475（1）：57－63.

［21］Li K.Monoclonal18A4 against AGR2 inhibit human breast adenocarcinoma cell growth and migration［D］.Shanghai：Shanghai Jiao Tong University，2011.

［22］Vanderlaag KE，Hudak S，Bald L，et al．Anterior gradient-2 plays a critical role in breast cancer cell growth and survival bymodulating cyclin D1，estrogen receptor-alpha and survivin［J］.Breast Cancer Res，2010，12（3）：R32.

［23］Hu Z，Gu Y，Han B，et al．Knockdown of AGR2 induces cellular senescence in prostate cancer cells［J］.Carcinogenesis，2012，33（6）：1178－1186.

［24］Ma SR，Mao L，Deng WW，et al．AGR2 promotes the proliferation，migration and regulates epithelial-mesenchymal transition in salivary adenoid cystic carcinoma［J］.Am J Transl Res，2017，9（2）：507－519.

［25］Wang Z，Hao Y，Lowe AW.The adenocarcinoma-associated antigen，AGR2，promotes tumor growth，cell migration，and cellular transformation［J］.Cancer Res，2008，68（2）：492－497.

［26］Hollstein M，Sidransky D，Vogelstein B，et al．p53 mutations in human cancers［J］.Science，1991，253（5015）：49－53.

［27］Hrstka R，Bouchalova P，Michalova E，et al．AGR2 oncoprotein inhibits p38 MAPK and p53 activation through a DUSP10-mediated regulatory pathway［J］.Mol Oncol，2016，10（5）：652－662.