MiR-217对小鼠胰腺成体干细胞增殖的调控作用

吴 琼，卢 洲，马东慎，邢 芸，金 亮

（中国药科大学生命科学与技术学院，南京210009）

胰岛移植是一种新的有效控制1型糖尿病的方法，然而胰岛来源有限，移植免疫排斥等问题限制了胰岛移植的发展［1］。现代科学技术能够成功地体外培养胰腺成体干细胞，这一技术有望解决胰岛缺失这一难题［2－4］，众多的信号通路在胰腺干细胞的生长发育过程中有着广泛的调节作用［5－8］，但其生长机制尚不完全明确。

MicroRNA是一种长度为18～24个核苷酸组成的短链非编码RNA，在细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移等过程中扮演重要角色［9－12］。miR-217是一种已知的具有抑制细胞增殖的microRNA，在多种细胞的生长发育过程中发挥重要的调控作用。在人胰腺导管腺肿瘤中，miR-217通过靶向Tpd52l2、Kras和E2F3等靶基因抑制细胞的增殖、侵袭和迁移［13－15］。在肝细胞癌中，miR-217靶向DKK1调控WNT信号通路进而影响肿瘤干细胞的干性［16］。但其在胰腺成体干细胞方面的研究尚未见报道。

本课题组前期对小鼠胰腺成体干细胞的高通量测序结果表明，与胰腺组织相比，在胰腺成体干细胞中miR-217的表达明显降低［17］。本研究通过探索miR-217对胰腺成体干细胞增殖的调控作用，为胰腺成体干细胞的进一步研究提供参考依据。

1 材 料

1.1 试 剂

DMEM／F12、DMEM高糖培养基、胎牛血清（美国 Gibco公司）；Lipo2000（美国 Thermo Fisher公司）；0.25%胰酶细胞消化液、双荧光素酶试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；miR-217 mimics（上海吉玛制药技术有限公司）；Western blot电泳设备（美国 Bio-Rad公司）；兔抗-Cyclin D1抗体（美国 Selleck公司）；Ki-67抗体、小鼠抗 Sirt1抗体、兔抗-GAPDH抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG和HRP标记的山羊抗兔IgG抗体［艾博抗（上海）贸易有限公司］；DAPI（南京凯基生物科技发展有限公司）；qPCR试剂（南京爱必梦生物材料有限公司和上海吉玛制药技术有限公司）；其他试剂均为市售分析纯。qPCR过程中所使用的引物和双荧光素酶报告基因载体构建中靶位点序列由苏州金唯智公司合成。

1.2 仪 器

480Ⅱ实时荧光定量PCR系统（上海罗氏制药有限公司）；细胞培养箱、离心机（美国 Thermo Fisher公司）；TS2R倒置荧光显微镜（日本尼康公司）。

1.3 动物和细胞

6～8周龄的C57BL／6清洁级小鼠购自扬州大学比较医学中心，许可证号为 SCXK（苏）2017-0007，所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。HEK293T细胞保存于本实验室。

2 方 法

2.1 细胞培养与转染

二维体系培养的小鼠胰腺成体干细胞的培养方法参照文献［17］，先用三维半固体体系培养胰腺成体干细胞的单克隆球，在无菌条件下用10μL枪头将其挑出，用0.25%胰酶将其消化成单细胞，按每孔1×105个细胞的密度铺于包被有matrigel胶的12孔细胞培养板中。HEK293T细胞使用DMEM高糖培养基（含100 U／mL青霉素，100μg／mL链霉素）培养。

当胰腺成体干细胞在细胞培养板中的融合度达到80%后，将培养基换成不含抗生素和血清的培养基300μL，将Lipo2000 1μL与miR-217mimics（20μmol／L）5μL加入到不含血清和抗生素的培养基100μL中，在室温下孵育15 min后，将转染混合物加入到二维培养的胰腺成体干细胞中。转染后3 h，将培养基更换成完全培养基，继续培养36 h。

2.2 免疫荧光技术检测Ki-67的表达

将培养的细胞先用4%多聚甲醛在室温固定15 min，加入配制好的0.2%Tritonx-100破膜液，使其能够充分浸润细胞，在室温下破膜作用30 min。每孔加入PBST＋1%BSA溶液300μL使其封闭，根据待检测一抗说明书按比例稀释一抗溶液，于4℃孵育过夜。用PBST清洗后加入相应的按比例稀释的二抗溶液，于37℃避光孵育染色1 h。DAPI复染后用PBST充分洗净后在倒置荧光显微镜下拍照。此实验中每个步骤结束后均用PBST清洗细胞3次。

2.3 Western blot法检测 Cyclin D1、Sirt1蛋白的表达

在细胞中加入RIPA裂解液（含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂）使细胞充分裂解，加入5×上样缓冲液溶液和PBS调整蛋白浓度为1μg／μL，于100℃金属浴中煮沸10 min。10%分离胶和5%浓缩胶电泳，电压为160 V，电泳持续约45 min。使用半干转的方法将蛋白转移到PVDF膜上，于5%脱脂牛奶中室温封闭1 h。分别加入相应的按1∶1 000稀释的一抗：rabbit anti-Cyclin D1，rabbit anti-GAPDH，mouse anti-Sirt1抗体，在4℃冰箱中过夜孵育。洗膜3次后加入相对应的二抗避光孵育1 h，继续洗膜3次后于曝光仪中曝光。

2.4 RNA的提取和qPCR

在每个细胞样本中加入Trizol裂解液1 mL将细胞充分裂解后提取细胞RNA，使用qPCR试剂盒，分别将RNA反转录成普通cDNA和miR-217的cDNA，将其加到96孔qPCR板中，进行实时定量PCR。qPCR过程中所使用的引物序列如表1所示。

Table 1 Primers used for qPCR

2.5 双荧光素酶检测实验

根据TargetScan网站预测miR-217的3个潜在的靶基因，并合成包含酶切位点和目的片段3′-UTR种子序列的59 bp的片段。片段序列如表2所示。

Table 2 Sequence used for luciferase report assay

将合成的单链退火，使用T4-DNA连接酶将退火产物与酶切后的PMIR-REPORT质粒进行连接重组，并将其转化进大肠埃希菌中，提取质粒。microRNA与PMIR-REPORT重组质粒、海肾质粒共转染到HEK293T细胞：提前将HEK293T细胞均匀铺到24孔板中，转染3种质粒，每种设置3个平行孔。HEK293T铺板密度为每孔2×105个，体系500μL，转染前将24孔板中细胞换成400μL不含抗生素和血清的培养基，4～6 h后开始转染。转染结束后36 h使用双荧光素酶报告试剂盒对其荧光值进行检测。

2.6 统计学处理

3 结 果

3.1 Sirt1在胰腺成体干细胞中的表达

提取三维半固体体系培养的胰腺成体干细胞和小鼠胰腺组织的 RNA，将其反转录成 cDNA，qPCR方法检测胰腺成体干细胞中Sirt1 mRNA的表达水平。结果如图1所示，在mRNA水平，Sirt1的表达没有明显变化。

Figure 1 Expression of Sirt1 in mouse adult pancreatic stem cells detected by qPCR

提取小鼠胰腺成体干细胞和胰腺组织的蛋白质，验证胰腺成体干细胞中Sirt1蛋白的表达差异。实验结果显示（图2），在胰腺成体干细胞中Sirt1的蛋白表达明显升高。

Figure 2 Expression of Sirt1 in mouse adult pancreatic stem cells（PPCs）detected by Western blot

3.2 miR-217 mimics转染的过表达效率

将三维体系培养的胰腺成体干细胞转到二维体系后，转染miR-217 mimics使miR-217过表达，其过表达效率如图3所示，与对照组相比，miR-217 mimics转染组中miR-217的表达显著上调，比对照组增高50倍。结果表明miR-217 mimics可以作为上调miR-217的有效工具。

Figure 3 Expression of miR-217 in miR-217 mimics-transfected mouse adult pancreatic stem cells***P＜0.001 vs contorl group

3.3 miR-217对细胞增殖的影响

为了验证miR-217对细胞增殖的影响，在二维体系中培养的胰腺成体干细胞中过表达miR-217，观察miR-217对增殖的影响。通过Western blot方法检测细胞增殖相关蛋白Cyclin D1的表达，实验结果如图4所示，通过转染 miR-217 mimics使miR-217的表达上调后，与对照细胞相比，miR-217能够降低细胞增殖相关蛋白Cyclin D1的表达。

Figure 4 Protein expression level of Cyclin D1 in miR-217 mimicstransfected mouse adult pancreatic stem cells

免疫荧光实验（图5）也表明在二维体系培养的胰腺成体干细胞中过表达miR-217后增殖相关蛋白Ki-67的表达也明显降低，这些结果一致说明miR-217能够明显抑制胰腺成体干细胞的增殖。

3.4 双荧光素酶报告基因筛选miR-217的靶基因

使用生物信息学的软件筛选miR-217的潜在靶基因，通过TargetScan软件预测出3个潜在靶基因：Sirt1、Maf和Pcna，并将其潜在靶基因的包含种子序列的3′-UTR序列构建在PMIR-REPORT质粒载体的萤火虫荧光素酶报告基因下游的MCS区。双荧光素酶报告基因结果显示（图6），只有Sirt1萤火虫荧光素酶的相对荧光值能够被miR-217抑制，而Maf和Pcna的萤火虫荧光素酶相对荧光值没有影响。实验结果说明Sirt1是miR-217的靶基因。

Figure5 Ki-67 expression inmiR-217mimics-transfectedmouseadult pancreatic stem cells（×200）

Figure 6 miR-217 directly targeting 3′UTR of Sirt1，but not Maf or Pcna，evaluated by dual-luciferase activity assay）***P＜0.001 vs contorl group

3.5 miR-217对Sirt1的靶向调控作用

为了进一步验证miR-217对Sirt1的直接靶向调控作用，通过qPCR和Western blot的方法验证miR-217对靶基因的调控作用，如图7中的qPCR结果显示，在胰腺成体干细胞中过表达miR-217后，其靶点的mRNA水平没有明显变化，表明miR-217对Sirt1的mRNA水平没有明显作用。然而，与对照组相比较，胰腺成体干细胞在过表达miR-217后Sirt1的蛋白表达明显被抑制，说明在胰腺成体干细胞中miR-217通过抑制Sirt1的蛋白表达来发挥对下游的调控作用。

3.6 Sirt1对细胞增殖的影响

为了验证Sirt1对胰腺成体干细胞增殖的作用，使用 Sirt1的激动剂白藜芦醇（Res，10μmol／L）和 Sirt1的抑制剂尼克酰胺（NAM，40 mmol／L）来验证Sirt1对胰腺成体干细胞中Cyclin D1表达的影响。实验结果如图8所示，白藜芦醇能够在蛋白水平和mRNA水平促进Cyclin D1的影响，而尼克酰胺对其具有抑制作用。

Figure 7 Sirt1 expression after transfected with miR-217 mimics detected with Western blot（A）and qPCR（B）

Figure 8 Proliferation rate of adult pancreatic stem cells.Cyclin D1 expression after treated with resveratrol（Res）or niacinamide（NAM）detected with Western blot（A）and qPCR（B）**P＜0.01，***P＜0.001 vs DMSO group

为了进一步验证Sirt1对胰腺成体干细胞成球能力的影响，在三维半固体培养体系中加入Sirt1的激动剂白藜芦醇和抑制剂尼克酰胺，实验结果如图9所示，加入白藜芦醇能够促进胰腺成体干细胞的成球能力，而当尼克酰胺的使用浓度为40 mmol／L时，能够明显抑制胰腺成体干细胞的成球能力。综上所述，促进Sirt1能够促进胰腺成体干细胞的增殖能力，而抑制Sirt1能够抑制胰腺成体干细胞的增殖。

Figure 9 Colony formation ability of pancreas resulted from Res and NAM，respectively（×40）.（A）control；（B）Res 10μmol／L；（C）NAM 40 mmol／L

4 讨 论

为了寻找胰岛移植的替代物，人们通过培养胚胎干细胞成功将其诱导为能够分泌胰岛素的细胞，但其来源缺乏以及存在伦理等问题，胚胎干细胞的运用受到局限。对成体胰腺干细胞的体外培养已经稳定地建立起来，这对胰岛移植的治疗具有一定促进作用。

为了探索胰腺成体干细胞生长发育过程中的调控作用，本研究以前期的高通量测序结果为参考，以miR-217为研究对象。MicroRNA的调控是一个极其庞大又复杂的网络，本研究中过表达miR-217后能够明显抑制细胞增殖相关蛋白Cyclin D1和Ki-67的表达，说明miR-217能够抑制胰腺成体干细胞的增殖，在其发育过程中低表达的miR-217有助于维持其细胞增殖。为了进一步探索miR-217对胰腺成体干细胞增殖的抑制作用，通过Targetscan网站预测了miR-217的潜在靶基因，筛选出3个和胰腺成体干细胞发育存在相关性的基因。利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-217与其潜在靶点的直接相关性，验证了Sirt1是miR-217的一个靶基因。同时在胰腺成体干细胞中过表达miR-217后发现其靶点的蛋白水平的表达显著降低，说明miR-217通过靶向调控Sirt1来调控胰腺成体干细胞的增殖。

Sirt1是一种NAD＋依赖的蛋白去乙酰化酶，在调节基因沉默、细胞衰老、细胞代谢等方面发挥重要的作用［18］。白藜芦醇是Sirt1的激动剂，能够缓和成体干细胞的衰退［19］。在猪胎胰腺干细胞中，白藜芦醇通过调节Sirt1的表达，明显促进了胰腺干细胞的增殖［20］。本研究使用Sirt1抑制剂尼克酰胺和激动剂白藜芦醇来探索Sirt1在胰腺成体干细胞发育过程中对细胞增殖的影响，发现抑制Sirt1的表达后胰腺成体干细胞的成球能力和增殖被抑制，而提高Sirt1的表达后促进了胰腺成体干细胞的增殖。说明miR-217能够通过Sirt1信号通路来调节胰腺成体干细胞的增殖，然而，Sirt1是如何调控胰腺成体干细胞的增殖还需要进一步探索。

总之，本研究考察了miR-217对胰腺成体干细胞增殖的影响，初步探讨了其调控机制，为胰腺成体干细胞和糖尿病等胰腺疾病的治疗奠定了一定的理论基础。

［1］ Movahedi B，Keymeulen B，Lauwers MH，et al.Laparoscopic approach for human islet transplantation into a defined liver segment in type-1 diabetic patients［J］.Transpl Int，2003，16（3）：186－190.

［2］ Jin L，Feng T，Shih HP，et al.Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine／acinar colonies in laminin hydrogel［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110（10）：3907－3912.

［3］ Jin L，Feng T，Zerda R，et al.In vitromultilineage differentiation and self-renewal of single pancreatic colony-forming cells from adult C57BL／6 mice［J］.Stem Cells Dev，2014，23（8）：899－909.

［4］ Fu X，Jin L，Wang X，et al.MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110（44）：17892－17897.

［5］ Li X，Zhang Z，Li Y，et al.miR-18a counteracts AKT and ERK activation to inhibit the proliferation of pancreatic progenitor cells［J］.Sci Rep，2017，7：45002.

［6］ Gnatenko DA，Kopantzev EP，Sverdlov ED.Fibroblastgrowth factors and their effects in pancreas organogenesis［J］.Biomed Khim，2017，63（3）：211－218.

［7］ Zhang Z，Rankin SA，Zorn AM.Syndecan4 coordinatesWnt／JNK and BMP signaling to regulate foregut progenitor development［J］.Dev Biol，2016，416（1）：187－199.

［8］ Li XY，ZhaiWJ，Teng CB.Notch Signaling in Pancreatic Development［J］.Int JMol Sci，2015，17（1）：48.

［9］ Gu Y，Li XM，Zheng LF，etal.MicroRNA-10b regulates proliferation，cell cycle and apoptosis in human breast cancer cells［J］.J China Pharm Univ（中国药科大学学报），2015，46（2）：242－249.

［10］Wu BW，Wu MS，Guo JD.Effects ofmicroRNA-10a on synapse remodeling in hippocampal neurons and neuronal cell proliferation and apoptosis through the BDNF signaling pathway in a rat model of Alzheimer′s disease［J］.JCell Physiol，2017.doi：10.1002／jcp.26328.

［11］Liu P，Chang F，Zhang T，et al.Downregulation of microRNA-125a is involved in intervertebral disc degeneration by targeting pro-apoptotic Bcl-2 antagonist killer1［J］.Iran JBasic Med Sci，2017，20（11）：1260－1267.

［12］Koh H，Park H，Chandimali N，et al.MicroRNA-128 suppresses paclitaxel-resistant lung cancer by inhibiting MUC1-C and BMI-1 in cancer stem cells［J］.Oncotarget，2017，8（66）：110540－110551.

［13］Chen Q，Wang P，Fu Y，et al.MicroRNA-217 inhibits cell proliferation，invasion and migration by targeting Tpd52l2 in human pancreatic adenocarcinoma［J］.Oncol Rep，2017，38（6）：3567－3573.

［14］ZhaoWG，Yu SN，Lu ZH，et al.The miR-217 microRNA functions as a potential tumor suppressor in pancreatic ductal adenocarcinoma by targeting KRAS［J］.Carcinogenesis，2010，31（10）：1726－1733.

［15］Yang J，Zhang HF，Qin CF.MicroRNA-217 functions as a prognosis predictor and inhibits pancreatic cancer cell proliferation and invasion via targeting E2F3［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21（18）：4050－4057.

［16］Jiang C，Yu M，Xie X，et al.miR-217 targeting DKK1 promotes cancer stem cell properties via activation of the Wnt signaling pathway in hepatocellular carcinoma［J］.Oncol Rep，2017，38（4）：2351－2359.

［17］Ma D，Tang S，Song J，et al.Culturing and transcriptome profiling of progenitor-like colonies derived from adult mouse pancreas［J］.Stem Cell Res Ther，2017，8（1）：172.

［18］Lu SP，Lin SJ.Regulation of yeast sirtuins by NAD（＋）metabolism and calorie restriction［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1804（8）：1567－1575.

［19］Liu B，Ghosh S，Yang X，et al.Resveratrol rescues SIRT1-dependent adult stem cell decline and alleviates progeroid features in laminopathy-based progeria［J］.Cell Metab，2012，16（6）：738－750.

［20］Xu S，Sun F，Ren L，et al.Resveratrol controlled the fate of porcine pancreatic stem cells through the Wnt／beta-catenin signaling pathway mediated by Sirt1［J］.PLoS One，2017，12（10）：e0187159.