基于UPLC方法同时测定准噶尔柳花中的芦丁、木犀草苷、绿原酸、槲皮素含量

韩飞，王苗苗，毛琼玲，张倩，李慕春*

(1.新疆维吾尔自治区分析测试研究院,新疆 乌鲁木齐 830011;2.新疆天然产物绿色加工工程技术研究中心，新疆 乌鲁木齐 830011)

准噶尔柳(Salixsongarica)是杨柳科柳属的植物,分布在中亚地区、伊朗、阿富汗以及中国大陆的新疆等地，生长于海拔1 100～1 150 m的地区，多生在平原河谷以及荒漠小河边，目前尚未由人工引种栽培[1]。准噶尔柳是重要的药用植物，同杨柳科其他植物一样树皮可提取水杨甙[2～4]。水杨甙被称为“天然阿司匹林”，用于治疗轻微发热、感冒、感染、急性和慢性风湿不适等病症[5～6]。准噶尔柳花为准噶尔柳的干燥花序，具有清肺化痰、清热解暑、止咳安神的功效，当地维吾尔族居民常常将准噶尔柳花作为一种茶。目前，对准噶尔柳花的研究还未见报道。前期对柳花提取物进行系统预实验，发现柳花中黄酮含量较高[7]，其中黄酮类成分如芦丁[8]、槲皮素[9]、绿原酸[10]等具有降血脂、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等生物活性，木犀草苷[11]亦有抗癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡和凋亡增敏作用。本文利用UPLC对准噶尔柳花的水提取物和70%醇提取物中的黄酮成分进行液相检测，建立一种UPLC对准噶尔柳花中的芦丁、木犀草苷、绿原酸和槲皮素含量同时测定的方法，以期对准噶尔柳花的开发提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 药材

准噶尔柳花2016年9月采自新疆乌苏市，经新疆维吾尔自治区分析测试研究院天然产物所阿依古丽副研究员鉴定为杨柳科柳属准噶尔柳花，流式粉碎机粉碎过40目，待用。

1.2 试剂

芦丁(中国食品药品检定研究院，批号100080-201408)、木犀草苷(中国食品药品检定研究院，批号111720-200604)、绿原酸(成都曼思特生物科技有限公司,批号: 14091701)、槲皮素(成都曼思特生物科技有限公司,批号12020101)、无水乙醇、乙酸均为分析纯，甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水。

1.3 仪器

超高效液相色谱仪(美国Waters)；冷冻干燥机ALPHA2-4(德国CHRIST)；旋转蒸发仪(瑞士BUCHI)；电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；电热恒温水浴锅HHS(上海博讯实业有限公司)；冷却水循环机H50(莱伯泰科公司)；流水式粉碎机DYQ-188(瑞安市永历制药机械有限公司)。

2 方法与结果

2.1 供试样品的制备

称取冻干粉2.5 mg于25 mL的容量瓶中，甲醇溶解定容，配置成100 μg/mL的柳花水提、柳花醇提供试液。

2.2 标准品溶液及混合标准品溶液的配制

2.2.1 标准品溶液的配制

精密称取对照品芦丁、木犀草苷、绿原酸、槲皮素，分别用甲醇溶解定容至10 mL容量瓶中，摇匀，即得4个成分母液；再精密吸取芦丁、木犀草苷、绿原酸、槲皮素母液分别用甲醇定容到10 mL，得芦丁、木犀草苷、绿原酸、槲皮素200 μg/mL对照品储备液。

2.2.2 混合对照品的配制

分别吸取芦丁、木犀草苷、绿原酸、槲皮素 2.5 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18100 mm×2.1 mm，1.7 μm；流动相：乙腈(A)-0.2%乙酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～4 min，5%A→14%A；4～15 min，14%A→23%A；15～20 min，23%A→35%A；20～22 min，35%A→55%A；22～23 min，55%A→5%A；23～25 min，5%A)；流速：0.29 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：30 ℃；进样量：3 μL。

2.4 系统适用性考察

分别量取混合对照品溶液、供试样品溶液注入色谱仪，记录色谱图(图1)，结果芦丁、木犀草苷、绿原酸、槲皮素与样品中的其他成分能较好地分离。理论板数按芦丁、木犀草苷、绿原酸、槲皮素峰计算均不低于3 000。

1 绿原酸； 2 芦丁； 3 槲皮素； 4 木犀草苷。图1 混合对照品和供试品溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed reference substance and test sample solution

2.5 标准曲线的制备

精密吸取混合对照品溶液0、2、4、6、8、10 mL，分别置于10 mL的刻度比色管中，甲醇定容至刻度，摇匀，配置成系列浓度的混合对照品溶液，进样3 μL，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标绘制标准曲线，结果见表1。

表1 各组分标准曲线、相关系数、线性范围Table 1 Standard curves,correlation coefficients and linear range of each component

2.6 精密度实验

精密吸取混合对照品溶液3 μL，按2.3下色谱条件连续进样6次，测定待测成分峰面积，取6次数据进行计算，得出芦丁、木犀草苷、绿原酸、槲皮素的相对标准偏差。结果芦丁、木犀草苷、绿原酸、槲皮素峰面积的相对标准偏差分别为1.86%、1.61%、1.30%、1.51%，表明仪器的精密度良好。

2.7 稳定性实验

取同一供试溶液室温下放置0、1、3、5、7、9 h 后3 μL，按2.3条件进样，考察各化合物的稳定性。芦丁、木犀草苷、绿原酸、槲皮素峰面积的相对标准偏差分别为1.40%、1.07%、0.93%、0.78%，表明供试溶液在9 h内相对稳定。

2.8 重复性实验

选取同一批样品6份，精密称量，按2.1制备供试溶液，按2.3条件进行测定，计算待测成分的含量。结果样品中芦丁含量为5.633 mg/g，相对标准偏差为1.2%；木犀草苷含量为1.841 mg/g，相对标准偏差为1.5%；绿原酸含量为0.994 mg/g，相对标准偏差为2.4%；槲皮素含量为2.242 mg/g，相对标准偏差为1.6%。结果表明，方法的重复性良好。

2.9 加标回收实验

精密移取混合对照溶液1 mL 6份于250 mL锥形瓶中，用氮气吹干，在各个锥形瓶中加入已知含量的准噶尔柳花粉末0.5 g，按2.1所述制备供试溶液，按2.3所述条件进样，计算回收率。结果芦丁、木犀草苷、绿原酸、槲皮素平均加标回收率(n=6)，分别为99.9%、98.8%、97.6%、99.0%，相对标准偏差为1.6%、0.8%、1.7%、2.0%。

3 讨论

本实验采用PDA检测器进行全波长扫描(190 nm～450 nm)，结果360 nm处4个成分具有较大的吸收，杂质成分干扰少，故选择360 nm作为检测波长。流动相优选甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水、甲醇-乙酸水、乙腈-乙酸水等流动相系统，最终选择乙腈-0.2%乙酸水溶液为流动相，梯度洗脱为洗脱方式，样品分离度好。

含量测定时，芦丁、木犀草苷、绿原酸、槲皮素4种成分在准噶尔柳花中的含量表现出了较大的差异，从结果可以看出准噶尔柳花中芦丁含量最高，槲皮素含量仅次于芦丁。

本研究采用了梯度洗脱的方法同时测定柳花中芦丁、木犀草苷、绿原酸和槲皮素的含量，不仅简单、快速，而且分离度较好、适用面广。目前未见报道。从供试样品色谱图可以看出，目标峰分离效果较好,峰面积与浓度呈正相关，精密度、 稳定性、重复性和回收率的测定均符合实验要求。实验结果可用于新疆准噶尔柳花中含量的测定，为质量综合评价及药效的科学解释提供了准确、快速的定量分析方法，也为其质量控制提供了科学依据。从供试样品的色谱图中还可以看出，除已知的芦丁、木犀草苷、绿原酸和槲皮素外，至少还有两种含量较高的物质有待进一步研究确定。

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