扬子鳄胃蛋白酶原C基因克隆、序列分析及其表达

黄小梅，孙 龙，吴孝兵

1皖南医学院基础医学院病理教研室，安徽芜湖 241000 2安徽师范大学生命科学院安徽省重要生物资源保护和利用重点实验室，安徽芜湖 241000

ActaAcadMedSin，2018,40(2)：201-210

胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前体，由成年脊椎动物胃黏膜中的主细胞合成、分泌，在胃腔中胃液的酸性条件下，自动水解形成有活性的胃蛋白酶。胃蛋白酶是胃的一种具有消化功能的蛋白酶，其活性部位具有两个天冬氨酸残基，属于天冬氨酸蛋白酶家族[1]。运用一些分离技术(如硫酸铵分馏法)可以从胃黏膜中分离胃蛋白酶原，从胃液中纯化胃蛋白酶[2]。胃蛋白酶原和胃蛋白酶的蛋白质化学结构和功能均有研究[3- 5]。胃蛋白酶原用于观察胃上皮细胞发育[6]，并作为胃疾病尤其胃癌诊断的分子标记[7- 8]。目前，在哺乳动物中已经发现5种类型的胃蛋白酶原：胃蛋白酶原A、胃蛋白酶原B、胃蛋白酶原C(前胃亚蛋白酶)、胃蛋白酶原F和胃蛋白酶原Y(凝乳酶原)[9]。扬子鳄(Alligator sinensis)隶属爬行纲鳄目，是我国特有的珍稀爬行动物，扬子鳄穴居池沼，为一种凶猛的肉食性动物，研究其消化酶的结构和消化生理功能，为其今后配合饲料的研制提供科学依据，具有重要的生态价值和经济价值。国内学者对扬子鳄消化系统组织结构和酶的组织化学定位已有一些研究[10- 11]。然而，有关扬子鳄胃蛋白酶原的基因结构及分子特征等方面报道较少。本研究通过反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) 和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术，从扬子鳄胃黏膜组织中克隆一种编码胃蛋白酶原C(pepsinogen C，PGC)的基因序列，并利用生物信息学相关网站及软件，对其蛋白序列进行相似性比对并构建系统进化树；采用同源建模法，建立该胃蛋白酶原的三维结构模型，预测其活性位点；应用免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)和实时定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)法对该扬子鳄PGC的定位、定量表达进行分析；为进一步研究扬子鳄胃蛋白酶原的结构和功能关系奠定基础。

材料和方法

实验动物2015至2016年1、3、5、7、9、11月共采集12条成年扬子鳄，取自安徽宣城扬子鳄养殖中心。待工作人员屠宰完成后，取出完整内脏，立即按下列 8个部位取材：食道、胃体、十二指肠、直肠、肝、胰腺、卵巢和皮肤。生理盐水快速洗净，一部分组织剪碎保存于RNA样品储存液，放置于-80℃备用；一部分留取组织块，大小2.5 cm×2.0 cm，依其体积大小浸入4%多聚甲醛液中充分固定约8 h/cm3，梯度浓度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，切片厚约5 μm，用于HE和IHC染色。

主要试剂琼脂糖凝胶回收试剂盒及E.coliDH5α购于天根生物有限公司；Taq DNA聚合酶、RACE cDNA 扩增试剂盒购自生工生物工程(上海)技术服务有限公司；总RNA抽取试剂盒和cDNA单链合成试剂盒、pMD18-T载体试剂盒均由Takara公司生产。浓缩型PGC兔单抗、浓缩型SP免疫组织化学试剂盒和抗体稀释液均购自北京博奥森生物技术有限公司。Trizol、定量PCR用cDNA单链合成试剂盒、SYBR Green定量PCR试剂盒、PCR八连管均购自宝生物工程(大连)公司；BIO-RAD CFXTM荧光定量PCR仪借用公共实验室仪器。

胃总RNA提取活体解剖扬子鳄，取10～20 mg胃黏膜组织于1.5 ml不含RNA水解酶的离心管中，用Trizol试剂盒提取总RNA，所有操作严格按试剂盒说明书进行。用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

引物设计与合成根据GenBank上预测的鳄类胃蛋白酶原C基因序列，设计了1对用于PCR扩增部分序列的引物(F和R)，3条特异性5’RACE引物(5’-GSP1、5’-GSP2和5’-GSP3)，两条特异性3’RACE引物(3’-GSP1和3’-GSP2)，以及qPCR引物(PGCF和PGCR)。内参核糖体蛋白L8[12]引物(RPL8F和RPL8R)。所有引物(表1)均由生工生物工程(上海)技术服务有限公司合成。

RT-PCR及5’，3’-RACE扩增按反转录试剂盒说明书的方法合成cDNA作为PCR扩增模板。PCR反应体系(30 μl)：反转录产物cDNA 1.0 μl，3.0 μl 10× PCR Buffer，2.0 μl MgCl2，2.0 μl dNTP，1.0 μl各种引物，1.0 μl Taq DNA聚合酶和19.0 μl ddH2O；PCR反应程序：95℃预变性5 min，然后进入32个循环：95℃变性40 s，55℃退火50 s，72℃延伸50 s；最后72℃延伸10 min。5’-RACE和3’-RACE使用SMARTerTMRACE cDNA 扩增试剂盒，具体步骤按试剂盒说明书进行，PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR产物克隆及测序将以上 RT-PCR 产物、5’-RACE和 3’-RACE 扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，对目的条带进行切胶回收纯化，纯化后的DNA片段与载体pMD18-T进行连接构建重组克隆质粒，转化感受态E.coliDH5α，经LB 平板(含氨苄西林、异丙基硫代半乳糖苷和二甲基甲酰胺溶液)培养后，筛选重组子进行插入片段检测。序列测定由生工生物工程(上海)技术服务有限公司完成。

生物信息学分析应用DNASTAR软件EditSeq程序进行开放阅读框分析并将其推导为相应的氨基酸序列；通过NCBI(http：//www.ncbi.nlm.gov)BLASTX进行cDNA和蛋白质序列相似性检索；氨基酸序列比对应用GeneDoc软件及Clustal W(http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html)进行分析；使用ProtParam(http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html)预测蛋白质的分子质量、等电点等理化参数和基本性质分析；信号肽分析利用Signal P 3.0 server 程序(http：//www.cbs.dtu.dk/service/SignalP)；使用MEGA6软件构建系统进化N-J树；利用基于 SWISS-MODEL 服务器(http：//www.swissmodel.expasy.org/)的同源建模法[13]，构建扬子鳄胃蛋白酶的三级结构模型，利用PyMol软件对模型进行相关分析及显示。

表 1 扬子鳄胃蛋白酶原C基因PCR扩增所用引物Table 1 Primers used for PCR amplification of the pepsinogen C gene of Alligator sinensis

RT-PCR：反转录-聚合酶链反应；RACE：cDNA末端快速扩增；qPCR：实时定量聚合酶链反应

RT-PCR：reverse transcription-polymerase chain reaction；RACE：rapid amplification of cDNA ends；qPCR：quantitative real-time polymerase chain reaction

HE与IHC取7月成年扬子鳄食道、胃体、十二指肠、直肠、肝、胰腺、卵巢和皮肤组织蜡块，5 μm厚切片，每个标本切3张，1张用于常规HE染色，2张用于免疫组织化学染色。免疫组织化学采用SP法，具体操作按试剂盒说明书进行。用磷酸盐缓冲溶液替代一抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。在Olympus 显微镜下观察并摄片。

统计学处理采用Excel建立数据库，采用SPSS 16.0软件包统计处理，计数资料采用率和构成比表示，计量资料采用均数和标准差表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD法。

结 果

扬子鳄PGC基因cDNA部分序列的合成从扬子鳄胃组织中提取总RNA后，通过1%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色显示28s和18s rRNA条带清晰，说明所提取的总RNA完整性良好，可作为RT-PCR的模板。以反转录cDNA为模板，利用上游引物F和下游引物R进行PCR扩增，1.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示，在750～1000 bp有一条明显的目的条带，与预期的片段长度大小相符。测序得到一个长度为874 bp的序列。通过 NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)BLAST进行DNA 序列相似性搜索，结果表明该序列与密河鳄、湾鳄胃蛋白酶或酶原DNA序列相似性分别为98%、91%，故可推测该序列为扬子鳄胃蛋白酶原cDNA部分序列。

扬子鳄PGC基因cDNA全长序列的获得和分析利用特异性5’-RACE引物进行5’端巢式扩增，电泳在250～500 bp有一条明显的目的条带，与预期大小相符，测序得到一个长度为347 bp的序列(图1A)。同样以通用引物和特异性3’-RACE引物进行3’端扩增，测序得到一个长度为679 bp的序列(图1B)。

根据RT-PCR和RACE结果，获得扬子鳄PGC基因cDNA全长序列。通过NCBI比对分析预测出该基因的起始密码子ATG和终止密码子TGA位置。应用DNASTAR软件EditSeq程序进行开放阅读框分析并将其推导为相应的氨基酸序列，结果表明扬子鳄PGC基因cDNA序列全长1568 bp，包含编码 388个氨基酸残基的1167 bp开放阅读框，5’端非翻译区79 bp，3’端非翻译区322 bp，在多聚腺苷酸尾上游81 bp处存在加尾信号序列AATAAA(图2)。将该序列递交GenBank数据库，获得登录号为KY799383。

扬子鳄PGC蛋白的理化参数及其结构预测利用ProtParam预测扬子鳄PGC的理化性质，推测该蛋白的分子式为 C1887H2845N465O590S16，相对分子质量为41 998，理论等电点为4.16，理论半衰期大于 10 h，不稳定参数为43.37，属于不稳定蛋白。信号肽分析结果表明第1～16个氨基酸为扬子鳄PGC信号肽序列。采用CFSSP工具(http：//www.biogem.org/tool/chou-fasman)预测该蛋白二级结构中包含α螺旋、延伸带和随机卷曲3种形式，分别占46.9%、54.9%和12.9%。

M：DNA marker；1：RACE产物

M：DNA marker；1：RACE products

图15’-RACE(A)和3’-RACE(B)产物1.0%琼脂糖凝胶电泳检测图

Fig11.0% agarose gel electrophoresis of 5’-RACE(A) and 3’-RACE(B) products

PGC：胃蛋白酶原C；小写字母代表3’、5’端非翻译区；大写字母部分为编码区，上排为核苷酸序列，下排为氨基酸序列；下划线区域为信号肽；★表示终止密码子；多聚核苷酸加尾信号(AATAAA)用细线框标出；活性部位的天冬氨酸残基(D90、D275)用细线圆框标出；形成3个二硫键的6个半胱氨酸残基(C103、C108、C266、C270、C309、C343)用粗线方框标出

PGC：pepsinogen C；3’-，5’-untranslated regions are shown as lowercases；coding region is shown as uppercases，where the upper sequence indicates the nucleotide and the lower shows the amino acids;the region of putative signal peptide is underlined;a sterisk(★) indicates stop codon;putative polyadenylation signal(AATAAA) is marked with a thin line box;two aspartic acid residues associated with the active site motifs(D90，D275) are marked with a thin round frame;the six cysteine residues(C103，C108，C266，C270，C309，and C343) involved in forming three disulphide bonds characteristic of pepsinogen are indicated with a box of rough lines

图2扬子鳄PGC的cDNA序列及氨基酸序列

Fig2The cDNA sequences and deduced amnio acid sequences of PGC ofAlligatorsinensis

根据猪的胃蛋白酶原(蛋白数据库PDB编码为2PSG)的三级结构即模板蛋白(图3A)，利用 Swiss PdbViewer软件和 SWISS-MODEL 服务器构建扬子鳄PGC的三级结构模型(图3B)，结果表明所预测的扬子鳄PGC三级结构与模板蛋白非常相似，利用PyMol软件对模型进行相关分析，推测扬子鳄PGC的催化位点由Asp90和Asp2752个天冬氨酸残基组成；维持其空间结构的3个二硫键分别由Cys103和Cys108、Cys266和Cys270、Cys309和Cys343共6个半胱氨酸残基形成(图3B)。

基于脊椎动物PGC氨基酸序列同源性比对及系统进化关系分析从NCBI网站上搜索下载其他脊椎动物的PGC氨基酸序列，通过GeneDoc、Clustal X软件对不同物种的PGC氨基酸序列进行相似性比对,结果表明获得的序列与密河鳄PGC的相似性为98%，与湾鳄PGC的相似性为90%，与红边束带蛇PGC的相似性为55%；而与其他脊椎动物(如爬行类、鸟类、鱼类、哺乳类、两栖类)等PGC的相似性在51%～78%(表2、图4)。

Asp：天冬氨酸；Cys：半胱氨酸

Asp：aspartic acid；Cys：cysteine

图3根据2PSG蛋白三级结构(A)为模板构建扬子鳄PGC三级结构模型(B)

Fig3The predicted three-dimensional structure of the PGC fromAlligatorsinensis(B) with the three-dimensional structure of 2PSG as a template(A)

表 2 扬子鳄与GenBank中其他物种PGC氨基酸序列的同源性比对Table 2 Homology of the amino acid sequence of Alligator sinensis pepsinogen C to those of other organisms in GenBank

*代表绝对保守的氨基酸残基；：和.分别表示高度保守和低度保守的氨基酸残基；活性部位的天冬氨酸残基用方框标出；形成3个二硫键的6个半胱氨酸残基用灰色背景标出

*indicates the conserved residues;amnio acid subsititution leading to strong or no conservation of physiology chemical properties are indicated by：and.;two aspartic acid residues associated with the active site motifs are marked with a box;the six cysteine residues involved in forming three disulphide bonds characteristic of pepsinogen are indicated with a gray background

图4不同物种PGC cDNA 编码的氨基酸序列比对

Fig4Comparative analysis of putative amino acid sequences of PGC cDNA in different species

使用MEGA6软件邻位相连法对不同物种的PGC氨基酸序列构建系统进化树(图5)。用Bootstrap方法对构建的邻接树进行评估，参数设置如下：random number generator seed：111；number of bootsrap trials：1000。结果显示扬子鳄与密河鳄紧密聚为一支，再与其他鳄类聚在一起，然后与鸟类形成姐妹群(图5)。

扬子鳄PGC基因定位表达情况7月成年扬子鳄食道、胃体、十二指肠、直肠、肝、胰腺、卵巢和皮肤组织均进行了HE及IHC染色，结果显示只在胃黏膜组织中检测到PGC阳性反应，即在胃黏膜固有腺体上皮细胞胞质内可见棕黄色颗粒(图6)。

用MEGA6软件构建系统进化树，节点旁数据为邻位相连法分析1000次bootstrap检查后的置信度；比例尺等于Kimura双参数距离的0.05(邻位相连)单位

Phylogenies were determined with MEGA 6 software by bootstrap analysis using neighbor-joining(1000 replicates)；scale bar equals 0.05(neighbor-joining) unit of Kimura’s two-parameter distance

图5基于脊椎动物PGC氨基酸序列的系统进化树(邻位相连法)

Fig5Rooted the neighbor-joining tree based on the amino acid sequences of PGC from the vertebrates

A.胃黏膜组织(HE，×400)；B.胃黏膜组织PGC呈阳性(免疫组织化学染色，×400)

A.gastric mucosa tissue(HE，×400)；B.gastric mucosa was positive for PGC(immunohistochemical staining，×400)

图6PGC在扬子鳄胃组织中的分布

Fig6The location of PGC in the stomach tissues ofAlligatorsinensis

扬子鳄PGC基因定量表达水平

组织特异性表达水平：以核糖体L8为参比基因对样品进行RNA量校正，以食道为控制参量，分别对7月来源于同一条鳄的食道、胃体、十二指肠、直肠、肝、胰腺、卵巢与皮肤共8种组织进行qPCR，3次重复，实时定量PCR结果，7月成年扬子鳄不同组织中，PGC mRNA存在组织表达差异(图7)。结果表明同一月食道、胃体、十二指肠、直肠、肝、胰腺、卵巢和皮肤共8种组织中，胃的表达水平最高，其余几个器官均无表达(图7)。

生长周期特异性表达水平：以核糖体蛋白L8为参比基因对样品进行RNA量校正，1月胃为控制参量，分别取各月胃组织进行qPCR，3次重复。实时定量PCR结果显示，不同月成年扬子鳄胃组织中，PGC mRNA存在时期表达差异(F=35.95，P<0.05)(图8)。经LSD法两两比较分析显示7月胃中PGC的表达量最高，其次是9月，1、3、5和11月PGC mRNA表达量差异无统计学意义(图8)。

图7实时定量PCR方法检测成年扬子鳄不同组织PGC mRNA的表达

Fig7PGC mRNA expression in various tissues ofAlligatorsinensisby quantitative real-time polymerase chain reaction

与1、3、5、11月比较，aP<0.05

aP<0.05 compared with data in January，March，May，and November

图8实时定量PCR方法检测不同生长周期扬子鳄胃组织PGC mRNA的表达

Fig8The mRNA levels of PGC in the stomach ofAlligatorsinensisat different life stages by quantitative real-time polymerase chain reaction

讨 论

目前，在哺乳动物中已经发现5种类型的胃蛋白酶原：胃蛋白酶原A、胃蛋白酶原B、胃蛋白酶原C(前胃亚蛋白酶)、胃蛋白酶原F和胃蛋白酶原Y(凝乳酶原)[9]。胃蛋白酶原的多样性在很多脊椎动物中已经得到了证实。最早在1970年，人们在猪胃组织中发现了4种胃蛋白酶原：胃蛋白酶原A、胃蛋白酶原B、胃蛋白酶原C和胃蛋白酶原Y[14]。随后在人的胃中发现了3种胃蛋白酶原：胃蛋白酶原A、胃蛋白酶原C和胃蛋白酶原Y[15- 17]。Gildberg等[18]、Tanji等[19]、Douglas等[20]、Bobe 和 Goetz[21]分别在鳕、金枪鱼、美洲黄盖鲽、美洲红点鲑有胃真骨鱼类中发现有多种形式的胃蛋白酶原。本研究运用RACE法快速扩增，首次从扬子鳄胃黏膜中克隆并获得了一条长1568 bp的扬子鳄PGC基因cDNA全长序列，开放阅读框长1167 bp，编码388 个氨基酸；递交GenBank数据库，获得登录号为KY799383。在扬子鳄胃组织中是否存在多种胃蛋白酶原，有待进一步研究。

为了获得扬子鳄PGC结构与功能的信息，本研究利用相关生物信息学软件预测扬子鳄PGC的相对分子质量为41 998，理论等电点为4.16等理化参数；还利用已经纯化的猪胃蛋白酶原[13](PDB编码为2PSG)的三级结构为模板，构建了扬子鳄PGC的三级结构模型，推测扬子鳄PGC蛋白的催化活性中心由2个天冬氨酸残基Asp90和Asp275组成，而Cys103和Cys108、Cys266和Cys270、Cys309和Cys343形成的3个二硫键，可能对该蛋白的正常折叠、蛋白质构象的确定、空间结构的维持以及有效生理功能的发挥等有重要作用。这些结果为深入研究扬子鳄胃蛋白酶原结构与功能关系提供了有用的数据。

本研究获得的扬子鳄PGC氨基酸序列，与GenBank中其他物种PGC氨基酸序列进行同源性比对，并构建了系统进化树。从基于PGC氨基酸序列系统进化邻接树图中可以看出，脊椎动物PGC系统进化树基本上遵循传统进化分类，脊椎动物中鱼纲、鸟纲、爬行纲、哺乳纲和两栖纲分别聚成相近的进化分支，只是在个别目上存在特殊分支；扬子鳄与密河鳄亲缘关系最近，再与其他鳄类聚在一起，然后与鸟类形成姐妹群。本研究中的鳄类、鸟类及其他爬行类的PGC进化关系，与传统分类学存在分歧，传统分类学认为鳄类属于爬行纲，与其他爬行类的亲缘关系相对更近，而基于PGC氨基酸序列构建系统进化树却发现，鳄类先与鸟类聚到一起，再与其他爬行类相聚，即鳄类相对于爬行类与鸟类亲缘关系更近。这个结果与现在从分子生物学角度探讨系统进化关系所得结果一致[22- 25]。

胃蛋白酶原主要分布在胃，但也有报道胃蛋白酶原在其他器官中表达。例如，Bobe 和Goetz[21]发现美洲红点鲑的多种胃蛋白酶原不仅在胃中表达，而且在卵巢中也有表达。Kurokawa等[26]在没有胃的红鳍东方鲀中发现了一种胃蛋白酶原mRNA 不在消化器官表达，而是在皮肤组织表达。Inokuchi等[27]和Yakabe等[28]发现牛蛙的胃蛋白酶原不仅在胃，还存在于食管组织中。本研究对成年扬子鳄食道、胃体、十二指肠、直肠、肝、胰腺、卵巢和皮肤组织分别进行了IHC染色和qPCR检测，结果均表明PGC特异性地分布于胃黏膜组织。PGC mRNA组织特异性表达情况可能与组织特异性功能有关。

本研究用qPCR检测不同月(1、3、5、7、9、11月)成年扬子鳄胃组织中PGC mRNA的表达情况，结果显示PGC mRNA在7月胃中的表达量最高，其次是9月胃，其余几个月胃的PGC mRNA表达量低且差异无统计学意义。笔者推测得到这个结果的可能原因如下：1月为扬子鳄的冬眠期，3月处于冬眠后期、5月处于产卵前期、7月处于产卵期、9月处于产卵后期、11月份处于冬眠前期。PGC的表达量与扬子鳄的不同生产生活状况所需蛋白质的量不同密切相关，在产卵期前后都有所降低，只在产卵期升高，在冬眠前后期较产卵前后期更低。7月处于扬子鳄的产卵期，此生殖活动需要大量食物供应能量和营养，胃蛋白酶分泌增多，胃蛋白酶原在胃组织中表达量相应增加。11月和3月分别处于冬眠前期和冬眠后期，体内新陈代谢速率明显低于其他月，能量的产生与新陈代谢速率同步，这时能量限制会自动调整调节蛋白mRNA的表达[29]，进一步调整蛋白的含量。扬子鳄的不同生产生活状况下，胃蛋白酶原C的表达量不同，其调节机制尚不清楚。

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